梁宏伟，曹 磊，李 忠，邹桂伟

(1 中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223；2 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430070；3 华中农业大学 水产学院，湖北 武汉 430070)

黄颡鱼生长抑素基因的克隆及表达谱分析

梁宏伟1,2，曹 磊1,3，李 忠1,3，邹桂伟1,3

(1 中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223；2 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430070；3 华中农业大学 水产学院，湖北 武汉 430070)

【目的】 克隆黄颡鱼生长抑素(Somatostatin，SS)基因cDNA全长序列，分析其在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各个组织中的表达规律。【方法】 以黄颡鱼脑组织为材料，根据瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰SS基因保守区设计1对引物用于扩增SS基因中间保守区序列，再根据中间保守区序列设计2对引物，分别用于扩增5′端和3′端序列，将扩增得到的中间保守区序列、5′端和3′端序列拼接后得到黄颡鱼SS基因的cDNA全长序列，并对其进行生物信息学分析。用NCBI的Protein Blast对黄颡鱼与其他物种SS基因编码的氨基酸序列同源性进行比较，并构建系统发育树。用实时荧光定量RT-PCR检测SS基因在胚胎发育时期和胚后发育阶段(1～20 d)的表达特征。采用半定量RT-PCR检测SS基因在黄颡鱼脑、心脏、肌肉、胃、肝脏、肾脏、鳃、脾脏、性腺等组织中的表达特征。【结果】 黄颡鱼SS基因cDNA全长694 bp，其中5′端非翻译区139 bp，3′端非翻译区211 bp，开放阅读框为345 bp，编码114个氨基酸。黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼SS基因编码氨基酸同源性最高，为98%。系统发育树结果显示，黄颡鱼与同属于鲇形目的瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰聚为一支。SS基因在黄颡鱼受精卵时期就有表达，并持续至胚胎孵化出膜，且在心跳期和出膜期的表达量显著高于受精卵时期(P<0.05)；在出膜后的1～20 d，SS基因在黄颡鱼中稳定表达；在成鱼的各个组织中，SS基因只在脑组织中特异性表达。【结论】 初步探明了SS基因在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各组织中的表达规律，推测其可能在黄颡鱼胚胎发育中发挥着重要的生理功能。

黄颡鱼；生长抑素；基因克隆；表达特征

生长抑素(Somatostatin，SS)是一种由下丘脑分泌的抑制动物脑垂体分泌生长激素的神经调节肽，其具有激素和神经递质双重作用，广泛分布于中枢和外周神经系统及胃肠、胰腺等各种组织中，是脊椎动物生长发育的主要负调控因子[1-3]。SS首先是从羊的下丘脑提取液中分离得到的，是含有14个氨基酸的多肽，氨基酸序列依次为Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys[4]。最初分离得到的含14个氨基酸的多肽只是SS家族中的一类，SS家族含有不同氨基酸链长度和氨基酸组成多肽，在脊椎动物中主要存在SS-14和SS-28(SS-14的N端延长了14个氨基酸)2种生物活性多肽[5]。自20世纪80年代以来，国内外先后克隆得到了大西洋鳕鱼[6]、狗鲨[7]、虹鳟[8]、金鱼[9]、中华鲟[10]、鳜[11]、团头鲂[12]、齐口裂腹鱼[13]、牙鲆[14]、斜带石斑鱼[15]等多种鱼的SS基因。研究表明，SS具有抑制生长激素释放、参与调节渗透压和调控生长发育等方面的作用[16-18]。

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)是我国重要的淡水经济鱼类之一，属于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus)。近年来，黄颡鱼人工育苗技术和养殖业得到了飞速发展，通过生理学方法调控提高黄颡鱼苗种的成活率和生长速度，对于黄颡鱼养殖业的健康高效发展具有重要意义。本研究克隆获得了与黄颡鱼生长密切相关的SS基因，并分析其在胚胎发育阶段、早期发育阶段不同时期和成鱼不同组织中的表达规律，以期为今后黄颡鱼SS调控机制的研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用材料取自中国水产科学研究院长江水产研究所窑湾试验场。在胚胎发育阶段，连续取受精卵样品，各发育时期均取30粒；在胚后发育阶段，对出生1～20 d仔鱼连续取样；选取健康、无损伤的成体黄颡鱼，取其脑、心脏、肌肉、胃、肝脏、肾脏、鳃、脾脏、性腺等组织，样品采集后迅速冻于液氮罐，带回实验室于-80 ℃保存。

1.2 SS基因的克隆

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank已公布的鲇形目鱼类(瓦氏黄颡鱼，登录号HQ830200；斑点叉尾鮰，登录号NM_001200330)的SS基因cDNA序列，在其保守区内采用Primer 5.0设计引物S1，用于扩增黄颡鱼SS基因中间保守区序列。根据获得的黄颡鱼SS基因中间保守区序列，设计 5′ RACE 和3′ RACE特异性引物S2和S3，其中S2用于扩增SS基因的5′端序列，S3用于扩增SS基因的3′端序列。将扩增的保守区序列、5′端和3′端序列进行拼接得到黄颡鱼SS基因的cDNA序列全长。根据克隆的cDNA全长设计引物S4，作为检测SS基因定量表达的特异性引物。同时根据黄颡鱼β-actin基因(GenBank登录号：EU161066)，利用Primer 5.0软件设计内参基因β-actin的定量表达引物S5。所有引物由武汉擎科生物技术有限公司合成，相关信息见表1。

1.2.2 总RNA的提取和第一链cDNA的合成 将收集的成体黄颡鱼各个组织约100 mg、胚胎各发育期的30粒受精卵和胚后发育的仔鱼，分别利用Trizol Reagent(Invitrogen)按照使用说明提取总RNA。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用紫外分光光度计测定RNA浓度，之后于 -80 ℃保存备用。以总RNA为模板，根据RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0(TaKaRa)反转录试剂盒说明合成cDNA第一链。

1.2.3SS基因全长的扩增 以黄颡鱼脑组织的cDNA第一链为模板，用S1引物进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，Taq酶1.5 U，模板为1 μg，以ddH2O补足体积。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，36个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，用DNA回收试剂盒进行目的片段的回收和纯化，将回收产物连接到pMD-18T Vector，转化到DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行菌落PCR，并将PCR呈阳性的克隆送武汉擎科生物技术有限公司测序。分别采用引物S2和S3，通过SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美国) 试剂盒进行 5′ RACE、3′ RACE，用于扩增SS基因5′ 和3′ 端序列，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.2.4 生物信息学分析 将Sanger法测序的黄颡鱼SS基因中间保守区序列、5′端和3′端序列利用DNASTAR软件进行序列拼接，获得SS基因cDNA全长序列。再通过NCBI在线软件进行黄颡鱼cDNA序列同源性、开放阅读框和编码区分析；用在线软件Expasy(http://www.expasy.org/)预测SS基因编码蛋白质的分子质量和等电点；用软件ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)进行氨基酸序列疏水性分析；用NCBI的Protein Blast对黄颡鱼SS基因进行编码氨基酸的同源性比对，并采用MAGA 5.0软件构建包括黄颡鱼在内的20个不同物种(瓦氏黄颡鱼(登录号：ADX32485)、斑点叉尾鮰(登录号：NP001187259)、草鱼(登录号：ACB69423)、金鱼(登录号：AAD09359)、厚颌鲂(登录号：AAO92644.1)、斑马鱼(登录号：AAH76254)、大西洋鲑(登录号：NP001134573)、铠甲弓背鱼(登录号：AAK97070)、高首鲟(登录号：AAL13248)、中华鲟(登录号：ACN88148)、大西洋鳕(登录号：AAZ85702)、红鳍东方鲀(登录号：XP-003968367)、鳜AE(登录号：J89925)、斜带石斑鱼(登录号：AAU93565)、青鱂(登录号：XP_004084505)、金头鲷(登录号：AFO52507)、鸡(登录号：CAA42747)、牛(登录号：DAA33340)和人(登录号：NP-001039))SS基因编码氨基酸的系统发育树。

1.3 SS基因在胚胎发育和胚后发育时期表达的实时荧光定量RT-PCR检测

利用引物S4和内参基因β-actin的引物S5，来检测SS基因在黄颡鱼胚胎发育及胚后发育阶段的表达情况。实时荧光定量PCR的反应体系为20 μL，其中2×SYBR Real-time PCR Premixture 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40个循环。

1.4 SS基因在成鱼不同组织中表达的半定量RT-PCR检测

利用引物S4和内参基因β-actin的引物S5，来检测SS基因在黄颡鱼成鱼不同组织中的表达情况，半定量RT-PCR反应体系为15 μL，其中10×Buffer 1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.3 μL，Taq酶1.0 U，模板1 μg，以ddH2O补足体积。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，36个循环；最后72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物用20 g/L 琼脂糖凝胶进行检测并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 黄颡鱼SS cDNA的克隆

以引物S1扩增时，扩增到长度约为250 bp的特异性条带(图1)，对该条带克隆测序后经Blast分析，该条带序列与瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰等物种SS基因的一致性很高，故推测获得的序列是黄颡鱼SS基因的一部分;根据所获得cDNA部分片段设计引物S2和S3分别扩增SS基因5′端序列和3′端序列，扩增得到的片段长度约为189和366 bp，均与预期片段长度一致(图1)。将得到的3段核苷酸序列进行拼接，获得黄颡鱼SS基因的cDNA全长(GenBank登录号：JX441994)。

2.2 黄颡鱼SS基因的生物信息学

黄颡鱼SS基因cDNA全长共694 bp，其中 5′端非翻译区139 bp(1～139)，3′端非翻译区211 bp(483～694)，开放阅读框为345 bp，编码114个氨基酸。蛋白质预测结果显示，SS蛋白分子质量为 12 412.2 u，分子式为C538H874N154O166S8；理论等电点(pI)为6.26；该蛋白在水溶液中280 nm处的摩尔消光系数为7 240 mol/(L·cm)，不稳定系数为 43.69，说明该基因表达的蛋白为不稳定蛋白；若其成熟肽N端为丙氨酸时，在酵母和大肠杆菌中表达的半衰期分别大于20和10 h。疏/亲水性预测表明，该蛋白存在一个高分值峰(得分>1.5)，在第16个氨基酸处其疏水性最大值为3.078；存在8个低分值峰(得分<-1)，在第101个氨基酸处其亲水性最小值为-2.211，SS蛋白是一个亲水蛋白(得分<0)。

2.3 黄颡鱼SS基因编码的氨基酸序列比对及系统发育树的构建

用NCBI的Protein Blast对黄颡鱼SS基因所推导的多肽氨基酸序列进行同源性比对，黄颡鱼与同为鲇形目黄颡鱼属的瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachellii，登录号ADX32485)SS基因编码的氨基酸序列同源性最高，为98%，与鲇形目的斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus，登录号NP001187259)同源性为89%，与草鱼(登录号ACB69423)、金鱼(登录号AAD09359)、厚颌鲂(登录号AAO92644.1)、斑马鱼(登录号AAH76254)、大西洋鲑(登录号NP001134573)和铠甲弓背鱼(登录号AAK97070)的同源性分别为72%，73%，72%，73%，68%和75%，与鸡、牛和人的同源性也较高。表明该蛋白在不同物种中均有较高的保守性(图2)。

运用MEGA 5.0软件构建了20个不同物种SS基因编码氨基酸序列的系统发育树，结果(图3)显示，黄颡鱼与同属于鲇形目的瓦氏黄颡鱼、斑点叉尾鮰首先聚为一支，然后与草鱼、金鱼、厚颌鲂、斑马鱼、大西洋鲑和铠甲弓背鱼聚为一支。

2.4 SS基因在黄颡鱼胚胎发育阶段的表达

采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)检测黄颡鱼SS基因在胚胎发育阶段的表达情况，结果见图4。从图4可以看出，与受精卵时期相比，SS基因在黄颡鱼的2细胞期至囊胚期的表达水平略有下降，但差异不显著(P>0.05)；自原肠早期至出膜期SS基因表达量有增高的趋势，其中在心跳期、出膜期其表达量显著高于受精卵时期(P<0.05)。

2.5 SS基因在黄颡鱼胚后发育阶段的表达

图5显示，黄颡鱼在出膜后的1～20 d，SS基因都有表达，只是3～4 d表达量有所下降，在其他时间SS表达水平变化不大。

2.6 SS基因在黄颡鱼各组织中的表达

采用半定量RT-PCR检测黄颡鱼SS基因在心脏、肌肉、脑、胃、肝脏、肾脏、鳃、脾脏、性腺9个组织中的表达情况，结果表明，SS只在脑组织中特异性表达，在其他组织中都没有表达(图6)。

3 讨 论

SS是一种广泛分布于中枢和周围神经系统中的多功能肽，在鱼类中调节机体的生长、发育和代谢等多个生理过程[1-4]。本研究成功获得了黄颡鱼SS基因的cDNA全长序列(GenBank登录号为JX441994)，对包括黄颡鱼在内的20个不同物种SS基因编码氨基酸序列的同源性分析表明，SS基因在脊椎动物进化史中具有高度的保守性。从系统发育树来看，同为鲇形目的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰首先聚为一支，然后与草鱼、金鱼、厚颌鲂、斑马鱼、大西洋鲑和铠甲弓背鱼聚为一支，高首鲟、中华鲟与人、牛和鸡聚为另一支，该结果与Lin等[5]和Quan等[7]的研究结果相似，表明SS是一个比较古老的基因。

本研究中，SS基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育过程中的表达表明，在黄颡鱼整个胚胎发育时期，SS基因都有表达，从受精卵时期到囊胚期略有下降，但差异不显著(P>0.05)，从原肠早期至出膜期其表达量有升高的趋势，在心跳期和出膜期其表达量均较高，显著高于受精卵时期的表达量(P<0.05)。Xu等[6]在研究大西洋鳕鱼时发现，SS基因在大西洋鳕鱼胚胎期均有表达，且表达呈上升趋势。斜带石斑鱼的胚胎发育至幼体孵化过程中均可检测到SS的表达，且SS表达量随着胚胎发育时期的推进而升高，在出膜前表达量达到最高，出膜后表达量变化不大，维持在一个较高水平[15]。在虹鳟整个胚胎发育过程中也能检测到SS基因的表达，且随着胚胎发育时期的推进SS基因的表达量增加[19]。在斑马鱼胚胎发育过程中，SS基因在受精24 h后即可被检测到，从受精24 h到出膜期SS一直有表达，且表达量逐渐增加[20]。本研究中，在黄颡鱼胚后发育过程中，SS基因表达水平比较稳定。不同鱼类其SS基因在早期发育阶段的表达水平有所差异，但都是在出膜前表达量达到最大，且胚后时期维持在一个较平稳水平。黄颡鱼SS基因在出膜期表达量最高，胚后发育过程中其维持在一个平稳水平，从黄颡鱼胚胎发育过程中SS基因的动态表达水平来看，SS基因对黄颡鱼早期胚胎的发育无太大影响，其主要在原肠期开始发挥调控作用。

在不同物种的成体组织中，SS基因的表达情况不尽相同。Li等[10]在中华鲟的脑垂体、下丘脑、端脑、延脑中均检测到SS的表达；叶星[21]在斜带石斑鱼各个组织中得到了与中华鲟相似的结果，SS在端脑、脊髓、延脑、下丘脑、嗅球都有表达；代威等[11]在鳜脑组织中检测到了SS基因的表达。本研究中，SS基因只在黄颡鱼成鱼的脑组织中表达，这与上述研究结果一致。但前人在一些鱼类的外周组织中也检测到了SS的表达，如Kittilson等[22]运用Northern blot检测了SS在虹鳟体内各个组织的表达情况，发现脑、胃、肠组织都有SS的表达，其中以脑组织中SS表达量最高。黄颡鱼SS基因在脑中的特异性表达说明，SS是一种专一的调节激素，只参与中枢神经系统对生长激素释放的调控。

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Cloning and expression analysis ofsomatostatingene inPelteobagrusfulvidraco

LIANG Hong-wei1,2,CAO Lei1,3,LI Zhong1,3,ZOU Gui-wei1,3

(1YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheriesScience,Wuhan,Hubei430223,China;2FreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenterofHubeiProvince,Wuhan,Hubei430070,China;3CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China)

【Objective】 The objectives of this experiment were to clonesomatostatin(SS) gene sequence ofPelteobagrusfulvidracoand analyze the sequence and its expression characterization.【Method】 A pair of primers were designed based on conserved domain ofSSgene ofPelteobagrusvachelliiandIctaluruspunctatus.The conserved domain ofSSgene was cloned fromPelteobagrusfulvidracobrain total RNA by PCR method.Then two pairs of specific primers based on their middle conserved sequences were used to obtain 5′and 3′end sequences.The full sequence ofSScDNA ofPelteobagrusfulvidracowas obtained by combining the middle conserved fragment with 5′and 3′end sequences.The homologous analysis was performed based on encoding amino acid sequences ofPelteobagrusfulvidracoand other fishes using online Protein Blast,and Phylogenetic tree was constructed by MEGA 5.0.Real-time PCR was used to analyze the expression patterns during the embryonic development stage and postembryonic development stage ofSSgene (1-20 d).Distribution and expression levels ofSSgene in tissues including brain,heart,muscle,stomach,liver,kidney,gill,spleen and gonad were analyzed by semi-quantitative RT-PCR.【Result】 The full-length ofSScDNA inPelteobagrusfulvidracowas 694 bp,containing 139 bp 5′-untranslated region and 211 bp 3′-untranslated region.The length of open reading frame (ORF) was 345 bp encoding 114 amino acids and had high homology withPelteobagrusvachellii(98%).The phylogenetic analysis showed thatPelteobagrusfulvidraco,PelteobagrusvachelliiandIctaluruspunctatuswere from one group.The somatostatin gene was expressed in the whole embryonic development stage and postembryonic development of 20-day old juveniles.The expression levels in the heart beat stage and hatch out stage were significantly higher than in fertilized egg (P<0.05).SSmRNA was only detected in brain of adultPelteobagrusfulvidraco.【Conclusion】 The expression patterns of somatostatin gene were preliminarily proved and somatostatin gene may play an important role in postembryonic development ofPelteobagrusfulvidraco.

Pelteobagrusfulvidraco;somatostatin;gene clone;expression characterization

2013-11-01

国家“863”计划项目(2011AA100401)；国家水产种质资源平台项目

梁宏伟(1978-)，男，山西繁峙人，副研究员，主要从事水产动物遗传育种研究。 E-mail：lianghw@yfi.ac.cn

邹桂伟(1963-)，男，安徽庐江人，研究员，主要从事鱼类遗传育种研究。E-mail：zougw@yfi.ac.cn

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.030

S965.199；Q786

A

1671-9387(2015)03-0043-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.030.html