朱春平，李 燕，吴亚丽，常婧竹，刘 琳，高文明，李新生

(1 河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州450002;2 中国兽医药品监察所,北京100081)

H3N2亚型SIV核蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

朱春平1，2，李 燕1，吴亚丽1，常婧竹1，刘 琳1，高文明1，李新生1

(1 河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州450002;2 中国兽医药品监察所,北京100081)

【目的】 克隆和表达H3N2型猪流感病毒(SIV) A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的核蛋白(NP)基因，为制备NP抗体和SIV基因工程疫苗奠定基础。【方法】 提取SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的RNA，用RT-PCR扩增NP基因，将其定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体，构建重组表达载体，并将其转化入大肠杆菌Rosetta中表达，用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物，同时考察IPTG不同浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L)和不同诱导时间(2，4，6，8 h)对重组NP蛋白表达量的影响。【结果】 克隆到1 512 bp的NP基因，与预期的核蛋白基因大小一致，共编码498个氨基酸；构建的重组表达载体在大肠杆菌Rosetta中表达出了分子质量约60 ku的重组核蛋白，其主要以包涵体的形式存在。IPTG不同诱导浓度和不同诱导时间对重组NP蛋白表达量的影响均较小。【结论】 克隆和表达了H3N2亚型猪流感病毒的核蛋白基因。

猪流感病毒；核蛋白；H3N2亚型；大肠杆菌

猪流感(Swine influenza，SI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的猪的一种急性呼吸道传染病，其特征为高热、精神沉郁、流鼻涕、咳嗽、呼吸困难、衰竭等，常反复发作[1-4]。1918年美国首先报道了猪流感，1930年Shope等从衣阿华州分离到第1株H1N1亚型SIV[5]。1991年中国首次从猪群中分离到H1N1亚型SIV[6]。目前已发现的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2共10种不同的亚型[7-8]。根据病原学、血清学和流行病学的研究，我国目前发现的亚型有H1Nl、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2[9]，其中以H1Nl和H3N2亚型的流行和危害比较严重[10]。

SIV基因组由8个分节段的单股负链RNA组成，编码至少10种病毒蛋白。核蛋白(Nucleoprotein，NP)由第5节段的RNA编码，NP基因在流感病毒中高度保守[11-14]，而NP蛋白是流感病毒诊断中最具有代表性的蛋白。本研究对SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)株的NP基因进行了克隆，并在大肠杆菌系统中进行诱导表达，旨在为下一步猪流感病毒核蛋白单克隆抗体的筛选以及猪流感病毒诊断试剂和亚单位疫苗的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒及菌种 SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)株，由河南农业大学牧医工程学院动物性食品质量与安全实验室分离保存。

1.1.2 载体和感受态细胞 pET-28a(+)原核表达载体和Rosetta感受态细胞，由河南农业大学牧医工程学院动物性食品质量与安全实验室保存。

1.1.3 工具酶和主要试剂 M-MLV反转录酶、T4 DNA Ligase、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、胰蛋白胨、酵母提取物和高纯度琼脂糖等，均购自宝生物工程(大连)有限公司；2×TaqPCR Mix聚合酶，购自郑州博美生物技术公司；B型质粒小量快速提取试剂盒，购自北京博大泰克基因技术有限公司；B型小量DNA片段快速回收试剂盒(离心柱型)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗His-tag鼠单抗和DAB显色试剂盒，均购自康为世纪公司。

1.1.4 H3N2NP基因引物的设计与合成 根据GenBank上发布的NP基因参考序列(GenBank登录号：KF541240)，采用DNA Star 5.0和Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物：P1.5′-CCG-GAATTCATGGCGTCCCAAGGCACCAAAC-3′;P2.5′-CCGCTCGAGATTGTCATACTCTTCTG-CATTGTCT-3′。P1和P2 5′端下划线碱基分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物由深圳华大基因科技有限公司合成，预期扩增片段长度为1 512 bp，包含完整开放阅读框；经DNA Star 5.0计算，重组NP蛋白的大小约为60 ku。

1.2 方 法

1.2.1 H3N2亚型SIV的增殖与RNA的提取 将种毒按1∶10的体积比稀释，以0.2 mL/胚接种10日龄SPF鸡胚，37 ℃ 孵育72 h，收取尿囊液，8 000 r/min离心15 min，吸取上清液，采用TRIZOL法提取尿囊液中病毒的RNA。

1.2.2 H3N2亚型SIVNP基因的RT-PCR扩增 将1.2.1提取的RNA按Takara公司的M-MLV反转录酶说明书进行反转录合成cDNA,反应条件：70 ℃ 10 min，冰浴5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。以反转录获得的cDNA为模板扩增NP基因，PCR反应体系为25 μL:上、下游引物(25 mol/L)各0.5 μL，cDNA模板2 μL，Premix LATaq(0.1 U/μL) 12.5 μL，灭菌超纯水补足至25 μL。对NP基因引物设置退火温度梯度进行PCR扩增，通过核酸电泳结果选取最佳退火温度。PCR扩增程序为:95 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，59.4 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳并观察结果，采用B型小量DNA片段快速回收试剂盒对剩余的PCR产物进行切胶回收并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 pET-28a(+)-NP-R重组质粒的构建 对回收纯化的PCR产物和pET-28a(+)原核表达载体，分别用EcoRⅠ、XhoⅠ限制性内切酶进行同步双酶切，酶切体系根据EcoRⅠ和XhoⅠ说明书上的体系构建，将酶切体系瞬时离心后，于37 ℃恒温箱内酶切2 h。取酶切产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒说明书切胶回收目的片段。将酶切回收的目的基因与表达载体按照1∶3～1∶10物质的量比混合，并加入T4 DNA Ligase和缓冲液，在16 ℃下连接过夜。将连接的产物转化到Rosetta感受态细胞中，并取100 μL涂布在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培养12～16 h，挑取单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃摇菌，培养过夜。提取质粒，进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定，将鉴定为阳性的质粒命名为pET-28a(+)-NP-R。

1.2.4 重组NP蛋白的诱导表达及可溶性分析 将鉴定为阳性的重组质粒pET-28a(+)-NP-R转化到Rosetta感受态细胞中，挑取菌落，并对其进行增殖培养及测序鉴定，将鉴定为阳性的重组菌接种于新鲜的含卡那霉素终质量浓度为50 μg/mL的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养过夜至OD600约为0.6时，加入100 mmol/L IPTG至终浓度为0.6 mmol/L，37 ℃诱导振荡培养4 h后，12 000 r/min 离心3 min，每mL菌体沉淀用40 μL的双蒸水重悬，并加入10 μL的5×SDS Loading buffer混匀，水浴煮沸5 min，取10 μL上样进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色2 h和脱色液脱色4 h后观察电泳结果，试验同时设IPTG诱导和未诱导的转化pET-28a(+)的Rosetta感受态细胞(pET-28a(+)-Rosetta)为对照。

通过菌体裂解、离心、SDS-PAGE等可溶性分析方法对重组NP蛋白进行可溶性分析，发现NP蛋白以包涵体的形式存在，试验同时设IPTG诱导和未诱导的转化pET-28a(+)的Rosetta感受态细胞(pET-28a(+)-Rosetta)为对照。

1.2.5 重组NP蛋白诱导表达条件的优化 (1)IPTG浓度的优化。用接种环挑取阳性重组细菌的单一菌落，接种于含卡那霉素终质量浓度为50 μg/mL 的LB培养液中，在37 ℃摇床上培养到OD600约为0.6时，加入IPTG，使其终浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L，之后继续在37 ℃摇床上培养。6 h后，分别吸取IPTG终浓度不同的各组菌液1 mL，对菌液进行适当处理后，通过SDS-PAGE对处理好的菌液样品进行鉴定，以便确定IPTG的最佳诱导浓度。

(2)诱导时间的优化。用接种环挑取阳性重组细菌的单一菌落，接种于含卡那霉素终质量浓度为50 μg/mL的LB培养液中，在37 ℃摇床上培养到OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，然后继续在37 ℃对其进行诱导培养，分别在0，2，4，6 和8 h时各取1 mL菌液，对菌液进行适当处理后，通过SDS-PAGE进行鉴定，以便确定最佳的诱导时间。

1.2.6 重组NP蛋白的纯化及Western blotting鉴定 取200 mL诱导表达后的阳性重组菌，7 000 r/min 离心得菌体沉淀，加入溶菌酶至终质量浓度为1 mg/mL，再加入Triton X-100至终质量浓度为10 g/L，孵育45 min；将孵育好的菌体在冰浴下用300 W的功率进行超声破碎(2 s/9 s/100次)，得菌体裂解液，然后于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，得菌体裂解液上清和沉淀。纯化步骤按照《分子克隆实验指南(第3版)》进行[15]。纯化得到的重组NP蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，用50 g/L的脱脂奶粉室温封闭1 h，然后用1∶1 000 倍稀释的HRP标记的抗His-tag鼠单抗孵育，4 ℃过夜，孵育结束后用TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min。最后用DAB显色试剂盒显色。

2 结果与分析

2.1 NP基因的扩增与重组质粒的酶切鉴定

阳性重组质粒的酶切鉴定结果和目的基因的扩增结果见图1。由图1可知，扩增出了与预期目的片段长度相符的特异性目的片段，扩增的NP基因大小为1 512 bp，共编码498个氨基酸。用限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切重组质粒pET-28a(+)-NP-R，结果获得了与预期目的片段长度相符的2个片段。NP基因的测序结果经DNA Star 5.0分析发现，其与NP基因参考序列(GenBank登录号：KF541240)的同源性为100%，说明重组质粒pET-28a(+)-NP-R构建成功。

2.2 重组NP蛋白的诱导表达

将重组质粒pET-28a(+)-NP-R转化入宿主菌Rosetta内，经IPTG诱导，可在Rosetta中表达出带有His标签的重组蛋白。经计算，SIV NP蛋白的分子质量与载体上蛋白的分子质量相加，则重组NP蛋白的大小约为60 ku。表达菌经过处理后，进行SDS-PAGE电泳，用考马斯亮兰染色，再用脱色液脱色，结果显示，重组NP蛋白分子质量的大小与预期相符 (图2)，表明重组表达质粒转化入宿主菌，经过IPTG诱导后，成功表达出了重组NP蛋白。

图1 H3N2亚型SIVNP基因的RT-PCR扩增及重组质粒pET-28a(+)-NP-R的EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定
M1.DNA Marker DL2000;M2.DNA Marker DL5000;1.NP基因的RT-PCR扩增产物;2.pET-28a(+)-NP-R的双酶切产物
Fig.1 Amplification of swine influenza A virus (H3N2)NPgene by RT-PCR and double digestion identification of recombinant plasmid pET-28a(+)-NP-R withEcoRⅠandXhoⅠ
M1.DNA Marker DL2000;M2.DNA Marker DL5000; 1.RT-PCR amplification products ofNPgene;2.Plasmid pET-28a(+)-NP-R digested withEcoRⅠandXhoⅠ

2.3 重组NP蛋白的可溶性分析

对诱导的NP蛋白上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果(图3)显示，菌体裂解液的沉淀中含有目的蛋白，而上清中没有。由此可知，重组NP蛋白以包涵体的形式表达。

2.4 IPTG诱导浓度对重组NP蛋白表达量的影响

用不同浓度IPTG诱导表达产物，在约60 ku处出现目的蛋白条带(图4)。

BandScan 5.0软件扫描结果显示，经不同浓度(0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L)IPTG诱导，重组NP蛋白表达量分别占菌体总蛋白的32.6%，32.2%，33.2%，32.5%和30.6%，说明不同浓度IPTG对重组NP蛋白表达量的影响较小。

2.5 IPTG诱导时间对重组NP蛋白表达量的影响

用IPTG诱导不同时间，表达产物均在约60 ku处出现目的蛋白条带(图5)。BandScan 5.0软件扫描结果显示，经IPTG诱导不同时间(2，4，6和8 h)，重组NP蛋白表达量分别占菌体总蛋白的24.4%，30.4%，28.0%和28.9%，说明IPTG诱导时间对重组NP蛋白表达量的影响较小。

2.6 重组NP蛋白的Western blotting鉴定

Western blotting鉴定结果显示，重组NP蛋白在约60 ku处出现单一且特异的清晰条带(图6)，表明重组NP蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达，且与预测蛋白大小一致。

3 讨 论

近年来，国内外对SIV越来越关注，一方面是由于猪在禽流感和人流感传播中发挥着重要的中间宿主的作用，因而具有重要的公共卫生意义；另一方面，SIV是猪急性呼吸道疾病、猪流产以及免疫抑制等问题的一个主要诱因[16]。对猪流感进行及时、准确的诊断，是控制该病流行发生的基础。猪流感病毒的NP蛋白在不同亚型流感病毒中非常保守[17]，其诱导机体产生的细胞免疫可抵御不同亚型流感病毒的感染，具有良好的种间交叉反应性[18-19]，是流感病毒分型和诊断的基础。

本研究利用大肠杆菌表达系统对A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的NP基因进行了克隆和表达。而在本研究的前期试验中，将构建好的阳性质粒转入BL21(DE3)pLysS诱导处理后，经SDS-PAGE鉴定，在约60 ku处并未发现表达的重组NP蛋白。之后，又将构建好的阳性质粒转入Rosetta中，诱导处理后，在约60 ku处发现了表达的重组NP蛋白，Western blotting鉴定结果与预期结果完全一致。Rosetta菌种本身含有一种质粒，此质粒编码稀有密码子的tRNA，而这恰恰是BL21(DE3)pLysS菌种所不具备的，因此，SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)株的NP基因可能含有大量的稀有密码子，通过密码子在线分析网站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html证实了这一点，对NP基因的稀有密码子进行分析，结果显示该NP基因含有33%的稀有密码子，从而导致其可在Rosetta中表达，而在BL21(DE3)pLysS中不表达。

由于原核表达系统具有成本低和表达量高等优点，所以本研究结果为流感病毒诊断试剂的开发、亚单位疫苗的研制以及NP蛋白功能的研究等奠定了基础。

[1] 魏 宏,张德明,庄向生,等.猪流感福建流行毒株的分离、鉴定 [J].华南农业大学学报,2007,28(2):119-121.

Wei H,Zhang D M,Zhuang X S,et al.Isolation and identification of a prevalent swine influenza virus strain from Fujian [J].Journal of South China Agricultural University,2007,28(2):119-121.(in Chinese)

[2] 程珏益,徐 军,徐成刚,等.猪流感病毒的分离鉴定及毒力检测 [J].中国兽医杂志,2007,43(1):28-29.

Cheng J Y,Xu J,Xu C G,et al.Isolation and identification of swine influenza virus and virulence detection [J].Chinese Journal of Veterinary Medicine,2007,43(1):28-29.(in Chinese)

[3] 周庆丰,马静云,曹永长.等.H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达 [J].华南农业大学学报,2007,28(1):105-108.

Zhou Q F,Ma J Y,Cao Y C,et al.Prokaryotic expression of theHAgene of swine influenza virus H1N1 subtype [J].Journal of South China Agricultural University,2007,28(1):105-108.(in Chinese)

[4] 徐 军,董尚智,廖 明.等.规模化猪场H1亚型猪流感油乳剂灭活疫苗免疫的抗体变化动态 [J].中国兽医杂志,2007,43(1):59-60.

Xu J,Dong S Z,Liao M,et al.Efficacy of a H1 subtype swine influenza inactivated oil-emulsion vaccine in swine [J].Chinese Journal of Veterinary Medicine,2007,43(1):59-60.(in Chinese)

[5] 殷 震,刘景华.动物病毒学 [M].北京:中国科学出版社,1997:704-735.

Yin Z,Liu J H.Animals virology [M].Beijing:China Science Press,1997:704-735.(in Chinese)

[6] 郭元吉,Webster R G.猪型流感病毒血凝素基因的核苷酸全序列分析 [J].中华实验和临床病毒学杂志,1995,9(1):11-14.

Guo Y J,Webster R G.Swine influenza virus hemagglutinin gene nucleotide sequence analysis [J].Journal of Experimental and Clinical Virology,1995,9(1):11-14.(in Chinese)

[7] Ma W,Vincent A L,Gramer M,et al.Identification of H2N3 influenza A viruses from swine in the United States [J].Proc Nail Acad Sci USA,2007,104(52):20949-20954.

[8] Ma W,Gramer M,Rossow K,et al.Isolation and genetic characterization of new reassortant H3N1 swine influenza virus from pigs in the midwestern United States [J].J Virol,2006,80(10):5092-5096.

[9] 李海燕,于康震,杨焕良,等.中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定 [J].中国预防兽医学报,2004,26(1):1-6.

Li H Y,Yu K Z,Yang H L,et al.Isolation and identification of H5N1 and H9N2 influenza viruses from pigs in China [J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2004,26(1):1-6.(in Chinese)

[10] 李海燕,于康震,辛晓光.部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定 [J].动物医学进展,2003,24(3):67-72.

Li H Y,Yu K Z,Xin X G.Serological studies versus isolation and identification of swine influenza virus in different regions in China [J].Progress in Veterinary Medicine,2003,24(3):67-72.(in Chinese)

[11] Shu L L,Bean W J,Webster R G.Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1933 to 1990 [J].Virol,1993,67:2723-2729.

[12] 刘泽文,徐涤平,周平华,等.两株A型禽流感病毒NP基因的PCR扩增及序列分析 [J].动物医学进展,2004,25(4):96-98.

Liu Z W,Xu D P,Zhou P H,et al.Amplification and sequencing ofNPgene of two strain avian influenza virus [J].Progress in Veterinary Medicine,2004,25(4):96-98.(in Chinese)

[13] 朱建国,陆 苹.禽流感病毒核蛋白研究进展 [J].中国预防兽医学报,2003,25(1):72-73.

Zhu J G,Lu P.Research advance on the avian influenza virus nucleoprotein [J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2003,25(1):72-73.(in Chinese)

[14] Yang M,Berhane Y,Salo T,et al.Development and application of monoclonal antibodies against avian influenza,virus Nucleoprotein [J].J Virol Methods,2008,147:265-274.

[15] Sambrook J,Russelld W. 分子克隆实验指南 [M].3版.黄培堂,等译.北京:科学出版社,2002:1256-1258.

Sambrook J,Russelld W. Molecular cloning:A laboratory manual [M].3 rd edition.Huang P T,et al.translation.Beijing:Science Press,2002:1256-1258.(in Chinese)

[16] 仇华吉,童光志.猪流感的再认识 [J].动物医学进展,2000,21:6-9.

Qiu H J,Tong G Z.Reappraisal of swine influenza [J].Progress in Veterinary Medicine,2000,21:6-9.(in Chinese)

[17] Van Reese K,De Vleeschauwer A,Kyriakis K,et al.Influenza in birds，pigs and humans：Old theories versus current viewpoints [C]//Proceedings of the 19th IPVS Congress.Copenhagen,Denmark: Narayana Press,2006:1.

[18] Wiley J A,Hogan R J,Woodland D L,et al.Antigen-specific CD8+T cells persist in the upper respiratory tract following influenza virus infection [J].J Immuno,2001,167(6):3293.

[19] Rimmelzwaan G F,Boon A C M.Sequence variation in the influenza A virus nucleoprotein associated with escape from cytotoxic T Lymphocytes [J].Virus Res,2004,103:97.

Clone of nucleoprotein gene of influenza A virus (H3N2) and its expression inEscherichiacoli

ZHU Chun-ping1,2,LI Yan1,WU Ya-li1,CHANG Jing-zhu1,LIU Lin1，GAO Wen-ming1,LI Xin-sheng1

(1CollegeofHusbandryandVeterinary,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002,China; 2ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl,Beijing100081,China)

【Objective】 The nucleoprotein (NP) gene from swine influenza virus (SIV) A/swine/Henan/1/2010 (H3N2) was cloned and expressed to lay foundation for the preparation of NP antibody and genetic engineering vaccine of SIV.【Method】 The total RNA of SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2) was extracted.TheNPgene was amplified from the total RNA by using RT-PCR and it was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a(+) to construct recombinant expression vector.Then the vector was transformed and expressed inEscherichiacoliRosetta.The expressed protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting,and the expression levels of recombinant NP protein under different IPTG concentrations (0.2,0.4,0.6,0.8,and 1.0 mmol/L) and different induction times (2,4,6,and 8 h) were determined.【Result】 The clonedNPgene (1 512 bp) was consistent with the expected nucleoprotein gene,encoding 498 amino acids. Recombinant expression vector expressed inE.coliRosetta as recombinant nucleoprotein with the relative molecular weight of ～60 ku and mainly in the form of inclusion bodies.The expression level of recombinant NP protein was slightly influenced by IPTG concentration and induction time.【Conclusion】 H3N2 swine influenza virus nucleoprotein gene was successfully cloned and expressed.

SIV;nucleoprotein;H3N2;Escherichiacoli

2013-11-04

国家农业科技成果转化资金项目(2012GB2D000273)；河南省科技成果转化计划项目(122201110027)

朱春平(1989-)，男，河南汤阴人，在读硕士，主要从事动物病毒分子病原学研究。E-mail：woailanqiu.1989@163.com

李新生(1969-)，男，河南郑州人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事病毒病原学研究。 E-mail：harmony69@gmail.com

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.011

S852.65+9.5

A

1671-9387(2015)03-0001-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.011.html