崔垚鑫，刘俊华，周忆莲，刘燕霏，杨建德

铜绿假单胞菌遗传演化分析

崔垚鑫，刘俊华，周忆莲，刘燕霏，杨建德通信作者

（天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

为研究铜绿假单胞菌（Pa）的遗传演化规律，对2018年本实验室分离出两株铜绿假单胞菌，经基因测序得到16s rRNA基因序列，利用NCBI中的BLAST对比搜索与分离菌株具有相近基因序列的假单胞菌株，采用lasergene 中Megalign软件构建基因进化树并比较分析。结果表明：Pa菌株在基因进化树上聚为一支，说明Pa进化较稳定，分离出的两株Pa与来自日本的Pa（登录号为NR_113599）关系最为亲近，他们聚在一个次级分支上；分离菌株与来自美国的两株Pa（登录号为NR_117678与NR_114471）关系较亲近，而与来自德国的Pa（登录号为NR_026078）关系则较远。

铜绿假单胞菌；遗传演化；基因树；亲缘关系

铜绿假单胞菌，又称绿脓杆菌，为革兰阴性杆菌，该菌在1882年首先由Gersard氏从伤口脓液中分离到[1]。铜绿假单胞菌在环境中普遍存在，常见于正常人与动物肠道、皮肤上，也可在外伤、烧伤及尿道感染等处发现。铜绿假单胞菌可感染多种动物，造成不同程度的经济损失，常见的疾病如雏鸡的急性败血死亡、貂的出血性肺炎、羊的化脓性肺炎、竹鼠的急性死亡等[2-6]。近些年来，因为铜绿假单胞菌感染人与动物的报道与日俱增，逐渐引起了人们的注意。

16S rRNA基因长度约为1 542 bp，序列长度适中，其结构中既有保守区又有变化区域，是较良好的生物标识[7-8]。基因测序技术快速发展，特别是高通量测序（high-throughput sequencing，HTS）的出现，在微生物鉴别方面起到了一定的作用[9-10]。本试验对从本实验室分离出的两株铜绿假单胞菌的16S rRNA进行同源序列比较并构建基因进化树，探究其进化规律，对大范围内防治此类细菌感染提供参考依据。

1 材料

本实验室分离出的两株Pa[11]。

2 方法

2.1 基因的测序与筛选

对本实验室分离菌株Pa-zhu和Pa-zr进行16S rRNA测序，其Genbank登录号分别为MK713645和MK713646。利用NCBI网站上的BLAST比对，将Pa的基因序列输入到搜索框内，用在线BLAST工具进行比对，筛选基因一致性达到95%以上的多种假单胞菌。对这些序列进行下载，查看序列信息并记录。

2.2 基因进化树的构建

利用lasergene 中Megalign软件构建基因进化树并进行同源性比较分析。

3 结果与分析

3.1 基因的筛选

在NCBI中使用BLAST对比工具，将分离菌株的16S rRNA序列输入搜索框内，可得到100个相似的基因序列，从中挑选21个来源明确、长度合适、同源性又达到95%以上的假单胞菌的 16S rRNA进行下载，见表1。

表1 假单胞菌16S rRNA 基因序列信息

菌株名称 国家 来源 登录号 序列长度/bp DSM 50071 Germany（德国） NCBI NR_026078.1 1 537 DSM 50071 USA（美国） NCBI NR_117678.1 1 527 ATCC 10145 USA（美国） NCBI NR_114471.1 1 489 NBRC 12689 Japan（日本） NCBI NR_113599.1 1 461 MCC10330 USA（美国） NCBI NR_043289.1 1 531 RA26 France（法国） NCBI NR_114957.1 1 379 ATCC 14235 USA（美国） NCBI NR_112062.1 1 507 ATCC 14909 USA（美国） NCBI NR_114472.1 1 459 NBRC 14159 Japan（日本） NCBI NR_113646.1 1 462 MI 33175 Korea（韩国） NCBI NR_117827.1 1 442 IPL-1 India（印度） NCBI NR_115922.1 1 438 Stanier 63 USA（美国） NCBI NR_037000.1 1 492 NBRC14167 Japan（日本） NCBI NR_113653.1 1 462 NBRC13583 Japan（日本） NCBI NR_113617.1 1 462 ATCC 8062 USA（美国） NCBI NR_114478.1 1 440 ATCC 25411 USA（美国） NCBI NR_114477.1 1 457 ATCC 17588 USA（美国） NCBI NR_041715.1 1 458 NBRC 14165 Japan（日本） NCBI NR_113652.1 1 462 ATCC 17588 China（中国） NCBI NR_103934.2 1 537 VKM B-075 Russia（俄罗斯） NCBI NR_116489.1 1 495 CCUG 11256 Spain（西班牙） NCBI NR_118798.1 1 456

3.2 基因序列同源性分析

采用lasergene 中Megalign软件分析基因同源性可以看出，分离出的Pa-zhu与来自日本的Pa（登录号为NR_113599）和来自美国的两株Pa（登录号为NR_114471.1与NR_117678.1）的同源性达到99%以上；与来自法国的Pa（登录号为NR_114957.1）的同源性则达到了98%以上，与其他菌株的基因序列相距较远。分离出的另一菌株Pa-zr与来自美国的两株Pa（登录号为NR_114471.1与NR_117678.1）的同源性达到99%以上；与来自日本的Pa（登录号为NR_113599.1）和来自美国的Pa（登录号为NR_043289.1）的同源性达到了98%以上，与其他菌株亲缘性较远，见图1。

图1 基因同源性关系分析

3.3 基因序列进化树的构建

将表1中的序列利用lasergene 中Megalign软件构建基因进化树并比较分析，见图2。可以看出，Pa菌株在基因进化树上聚为一支，说明Pa进化较稳定，分离出的两株Pa（登录号为MK713645和MK713646）与来自日本的Pa（登录号为NR_113599）的关系最为亲近，他们聚在一个次级分支上，且同源关系在98.4 %～99.2 %之间，推测在中国分离出的两株Pa与来自日本的Pa（登录号为NR_113599）是由共同的祖先在亚洲的不同国家间形成了交叉进化；分离菌株与来自美国的两株Pa（登录号为NR_117678与NR_114471）的关系较亲近，同源关系在99.0 %～99.4 %之间；而与来自的德国的Pa（登录号为NR_026078）关系则较远，同源关系在95.8 %～96.1 %之间。从本国分离出来的两株Pa在进化树上与其他假单胞菌的关系较远。

图2 铜绿假单胞菌遗传进化树分析

4 讨论

铜绿假单胞菌为人类医学中的常见菌类，但在近些年，Pa给养殖业造成了一定的损失，铜绿假单胞菌可引起犊牛便血、雏鸡内脏出血和羊剧烈腹泻，最终导致动物死亡[12]。通过研究分离出的铜绿假单胞菌与其他假单胞菌的遗传演化关系，可以为预防和治疗铜绿假单胞菌造成的疾病提供一定的理论依据。

本研究发现，所有的铜绿假单胞菌全部汇聚在一个分支上，说明铜绿假单胞菌在基因进化中相对稳定，且铜绿假单胞菌的进化节点较靠前，说明铜绿假单胞菌在假单胞菌中属于较古老的品种。从我国分离出的菌株（登录号为MK713645和MK713646）与日本的铜绿假单胞菌（登录号为NR_113599）和美国的两株铜绿假单胞菌（登录号为NR_117678与NR_114471）源自同一祖先，这可能与这几个国家经贸或旅游往来密切有关，了解发达国家铜绿假单胞菌的研究可为我们防治此类感染提供重要的参考依据。铜绿假单胞菌与属内其他假单胞菌也存在一定的亲缘关系，但遗传关系相对较远。施氏假单胞菌（与产碱假单胞菌（）在基因进化树上分别各聚一支，二者在基因进化树上的支点相对靠后，说明两种菌株虽然品种较新，但在进化过程中也趋向稳定。而食油假单胞菌（与类产碱假单胞菌（）在基因树上聚为一支，说明两株菌株在进化趋势上相对稳定，两者是由同一祖先进化而来的[13-14]。

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Genetic Evolution Analysis of

CUI Yao-xin, LIU Jun-hua, ZHOU Yi-lian, LIU Yan-fei, YANG Jian-deCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to study the genetic evolution of（Pa）, two strains of Pa were isolated in our laboratory in 2018. The 16s rRNA gene sequence was obtained by gene sequencing. The BLAST in NCBI was used to search forstrains with similar gene sequence to the isolated strains, and Megalign software in lasergene was used to construct the gene evolutionary tree and make comparative analysis. The results showed that Pa strains clustered into one branch on the gene evolution tree, indicating that Pa evolution was relatively stable. The two isolated Pa strains had the closest relationship with Pa from Japan（login number is NR_113599）, and they clustered on a secondary branch. The relationship between the isolated strain and Pa（Genbank login numbers NR_117678 and NR_114471）from the United States is relatively close. However, the relationship with Pa from Germany（login number is NR_026078）was far away.

; genetic evolution; gene tree; genetic relationship

1008-5394（2020）02-0052-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.012

S852.61

A

2019-05-13

国家级大学生创新创业项目（201810061047）；天津市自然科学基金项目（07JCYBJC16000）

崔垚鑫（1997-）男，本科在读，研究方向：预防兽医学。E-mail：1977008536@qq.com。

杨建德（1969-）男，教授，博士，主要从事预防兽医学方面的教学与研究。E-mail：jiandeyang@126.com。

责任编辑：张爱婷