张伟宏，蒋莉莉，汪晓凯，赵秋民，杨东斌，黄贯峰，张焕云，杨　阳，梁　芳，韩　雷，吴细丕

1)郑州大学护理学院 郑州 450001　2) 鹤壁市人民医院 鹤壁 458030　3) 郑州大学学报编辑部 郑州 450001　4)郑州大学附属中心医院 郑州 450052　5)河南省眼科研究所 郑州 450003



黄曲霉菌感染小鼠角膜动物模型的建立及组织病理学变化*

张伟宏1，2)，蒋莉莉1)，汪晓凯1)，赵秋民3)，杨东斌2)#，黄贯峰2)，张焕云2)，杨阳2)，梁芳4)，韩雷5)，吴细丕5)

1)郑州大学护理学院 郑州 4500012) 鹤壁市人民医院 鹤壁 4580303) 郑州大学学报编辑部 郑州 4500014)郑州大学附属中心医院 郑州 4500525)河南省眼科研究所 郑州 450003

关键词角膜炎；黄曲霉菌；小鼠

摘要目的：建立黄曲霉菌感染小鼠角膜动物模型，并观察病变后不同时期角膜组织病理学变化。方法：用培养接种棒对40只C57BL/6小鼠进行仿真临床角膜划痕导致真菌感染。在第1、3、5、7和14天行裂隙灯显微镜检查评分，随后处死小鼠制作角膜铺片，免疫荧光染色后进行激光扫描共聚焦显微镜观察。结果：术后第1、3和5天，接种眼临床评分升高迅速，在第5天达到峰值，随后第7和14天临床评分逐渐降低；术后第1天接种眼角膜缘组织已有中性粒细胞浸润、角膜巩膜缘血管扩张充血等明显急性炎症变化，第3天角膜巩膜缘出现新生血管芽，中性粒细胞向角膜中央溃疡灶浸润、聚集，第5天中性粒细胞浸润进一步加重，见侵入角膜基质层放射状生长的新生血管，第7天中性粒细胞浸润仍较严重，新生血管向角膜中央溃疡灶生长明显，管腔增粗，第14天中性粒细胞明显减少，新生血管萎缩、减少。结论：成功建立黄曲霉菌角膜炎小鼠动物模型；感染第5天可能是角膜炎症过程中的关键时间窗。

AbstractAim: To establish an effective mouse model of simulated clinical corneal fungal infections and observe the pathological changes of corneal tissue lesions after different periods of fungal keratitis.Methods: Forty C57BL/6 mice models were inoculated with a culture stick simulated clinical corneal scratches which caused fungal infections.On the 1st,3rd, 5th,7th and 14th day, infectious corneas were observed and given clinical scoring by slit-lamp biomicroscope，and then the mice were killed to make corneal stretched preparation. After immunofluorescence staining, the corneal tissue were observed with laser scanning confocal microscope. Results: The clinical scoring increased sharply on the 1st,3rd and 5th day after inoculation and peaked on the 5th day, then decreased on the 7th and 14th days. On the 1st day,the eye limbal tissue had neutrophil infiltration,corneal limbal vascular dilatation and congestion and other significant acute inflammatory changes.On the 3rd day,there were limbal corneal neovascularization buds, and neutrophil infiltration to gather corneal ulcer lesions. On the 5th day neutrophil infiltration further aggravated and invasive corneal stroma radial growth of new blood vessels could be seen. On the 7th day neutrophil infiltration was still severe, neovascularization obvious grew to the central cornea ulcer lesions,and luminal enlargement could be found on the 14th day neutropenia decreased significantly, and neovascularization atrophy reduced. Conclusion: An animal model of aspergillus keratitis has been successfully established. The key time window is the 5th day during the inflammation process of fungal keratitis.

角膜外伤尤其是植物性外伤引发的真菌性角膜炎是一种严重致盲性眼病。中国是真菌性角膜炎发病大国，致病真菌以镰刀菌和曲霉菌为主[1-2]。近年来，真菌性角膜炎发病率有逐年升高的趋势，由于缺少理想的动物模型，导致真菌性角膜炎发病机制的研究相对滞后。尽管以往研究[3-5]中有通过角膜基质注射法、角膜接触镜法及免疫抑制法等建立真菌性角膜炎动物模型的报道，但因其不符合真菌性角膜炎的自然发病过程而制约该病发病机制的研究。已有研究[6-7]表明：白细胞尤其中性粒细胞作为机体内初始免疫活性细胞，能迅速吞噬、消灭入侵的病原微生物。但是中性粒细胞向感染部位的迁徙是一把双刃剑，过度的浸润常造成炎症组织的损伤甚至破坏。因此，该实验拟模拟临床角膜外伤建立近似自然真菌感染小鼠角膜动物模型，并对其病变过程及真菌感染后不同时期小鼠角膜中性粒细胞和新生血管等病理学变化进行观察。

1材料与方法

1.1材料40只体重17~20 g雌性C57BL/6纯系小鼠，6～8周龄，健康无眼疾(河南省实验动物中心，许可证号：SCXK豫2005-0001)；动物的饲养与使用均按照科研动物使用规范进行。中国真菌菌种保藏中心提供黄曲霉菌(编号：3.2758)，FITC标记的Gr-1抗中性粒细胞抗体和PE标记的CD31血管内皮细胞抗体(美国Baylor医学院李志杰教授惠赠)。

1.2实验方法

1.2.1真菌菌种制备将标准菌种溶于生理盐水，转接在新鲜的马铃薯葡萄糖培养基斜面上孵育，连续转接2次培养。28 ℃培养3 d后，将已灭菌的接种棒置于马铃薯葡萄糖培养基斜面上28 ℃培养3 d。

1.2.2动物模型的制作40只C57BL/6纯系小鼠左眼设为手术对照，右眼接种黄曲霉菌。妥布霉素点眼，3次/d，持续3 d后小鼠腹腔内注射2 g/L戊巴比妥钠溶液行全身麻醉(剂量为20 mL/kg)，利多卡因点眼表面麻醉，然后用5 mg/L庆大霉素溶液冲洗右眼结膜囊，常规消毒铺巾，眼科手术用显微镜下，2 mm环钻在角膜中央用亚甲蓝标记定位后，取已培养好的接种棒在定位的区域内作“*”形划痕，深度为破坏角膜上皮到达浅基质层，结膜囊内涂抹红霉素眼膏，3-0丝线缝合上下眼睑。对照眼用已灭菌未培养的接种棒划痕接种，余同模型眼。术后妥布霉素点眼，3次/d。造模后随机分为第1、3、5、7和14天组，每组8只。

1.2.3真菌感染角膜的临床评分相应时间点每组小鼠进行裂隙灯显微镜检查，参照Hiraoka等[8]制定的评分系统对感染眼进行综合盲评。①角膜溃疡范围：病灶直径<2 mm评为1分，≥2 mm但未累及全角膜评为2分，病灶累及全角膜评为3分。②角膜混浊度：轻度角膜水肿评为1分，角膜水肿大于50%评为2分，全角膜混浊评为3分。③角膜新生血管形成：角膜巩膜缘少量新生血管形成评为1分，新生血管向角膜中央生长小于50%区域评为2分，新生血管向角膜中央生长大于50%区域评为3分。④前房积脓：前房内少量灰白色脓性渗出评为1分，前房积脓可看到液平、但未连接角膜病灶部位评为2分，前房积脓连接角膜病灶部位或出现连接角膜病灶的内皮斑评为3分。有下列症状的加上相应的得分：后弹力膜膨出加1分，角膜穿孔加1分，眼前房出血加1分，虹膜炎加1分。感染的严重程度以每只眼的总得分作为评估标准。

1.2.4角膜刮片及真菌培养相应时间点每组小鼠行角膜刮片，行KOH湿片与Giemsa染色后，光学显微镜下观察；并在小鼠角膜病灶部位钳取少量组织，采用新鲜的萨氏培养基进行接种。

1.3角膜组织中性粒细胞和新生血管的免疫荧光染色检测相应时间点分别处死每组小鼠，取眼球，在眼球赤道用手术刀穿透性切取带角膜缘的眼前节后，置于新鲜配制的PBS中进行虹膜的剥离；已分离干净的眼前节组织置于10 g/L多聚甲醛-PBS溶液中固定30 min后，使用PBS对已固定组织漂洗3次；漂洗干净的组织在20 g/L BSA-PBS溶液中浸泡15 min，然后用体积分数2%的Triton X-100-PBS溶液对其透膜15 min；最后将组织置于抗Gr-1单克隆荧光抗体和CD31血管内皮细胞荧光抗体液中(均按1200稀释)，4 ℃冰箱内避光孵育过夜后使用PBS漂洗未结合抗体3次；手术刀放射状切开后平铺于载玻片上，使用胶水固定，盖玻片压平，常温避光过夜[9-10]；将载玻片放入观察区域，用激光扫描共聚焦显微镜观察中性粒细胞和新生血管的变化。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析进行不同时间点接种眼临床评分结果的比较，检验水准α=0.05。

2结果

2.1裂隙灯显微镜下临床表现及临床评分小鼠接种眼全部形成真菌性角膜炎。接种后第1天可见角膜水肿混浊，表面粗糙不平，角膜巩膜缘血管扩张充血。第3天整个角膜呈现灰白色混浊，其中央部位有灰白色菌丝苔覆盖的浸润溃疡病灶，角膜巩膜缘血管充血减轻，有新生血管出现。第5天真菌感染角膜炎症达到峰值，角膜中央出现后弹力膜的膨出率为50%，角膜穿孔率为21%；角膜巩膜缘出现明显的向心性生长的新生血管以及前房积脓。第7天病灶化脓坏死逐渐减少，溃疡坏死区出现肉芽组织，溃疡病灶逐渐缩小，放射状向心性生长的新生血管接近病灶区。第14天角膜中央病灶已经瘢痕修复，深入到病灶的新生血管已逐渐退化。病灶周围角膜组织恢复正常。在上述时间点对接种眼进行临床评分，造模后第1、3、5天临床评分升高迅速，在第5天达到峰值(图1)，然后逐渐降低，评分分别为4.38±1.30、7.13±0.99、10.13±1.36、8.63±1.19和2.38±0.92；不同时间点内临床评分差异有统计学意义(F=58.475，P<0.001)。对照眼第1天角膜组织已基本恢复正常。

图1　黄曲霉菌感染后小鼠角膜裂隙灯显微镜检查结果

A：接种后第3天，评分为7分；B：接种后第5天，评分为11分；C：接种后第7天，评分为9分。

2.2角膜刮片检查和真菌培养情况接种后第1、3、5、7和14天角膜刮片行KOH湿片和Giemsa染色。接种眼KOH湿片显微镜下可看到明显的菌丝及孢子；Giemsa染色镜下可见明显菌丝，并且没有观察到细菌。真菌培养见相应菌属菌落且鉴定为所接种菌种(图2)。在第1和3天，KOH湿片、Giemsa染色和真菌培养阳性率未见明显差异，随后第5、7、14天各时间点角膜刮片检查和真菌培养的阳性率逐渐降低(表1)。对照眼未见病原菌感染。

图2　接种眼角膜刮片检查和真菌培养结果

表1　接种眼角膜刮片KOH湿片、

2.3角膜组织中中性粒细胞和新生血管观察结果

见图3。造模后第1天接种眼角膜缘组织已有中性粒细胞浸润、角膜巩膜缘血管扩张充血等明显急性炎症变化；第3天角膜巩膜缘出现呈毛刺状新生血管芽，大量中性粒细胞向角膜中央溃疡灶浸润聚集；第5天中性粒细胞浸润进一步加重，见侵入角膜基质层放射状生长的新生血管；第7天中性粒细胞浸润仍然较重，新生血管向角膜中央溃疡灶生长明显，管腔增粗；第14天中性粒细胞明显减少，新生血管萎缩、减少。对照眼第1天在角膜巩膜缘可见少量中性粒细胞散在分布，但未见新生血管的形成。A：接种后第3天，角膜巩膜缘向心性生长的新生血管以及新生血管周围呈毛刺状的新生血管芽(×400)；B：接种后第5天，向角膜中央病灶迁移的大量中性粒细胞以及病灶部位密布尚有轮廓的中性粒细胞(×200)；C：接种后第7天，角膜巩膜缘向心性生长粗大的新生血管以及从角膜巩膜缘向角膜中央迁移的大量中性粒细胞(×200)。

图3　接种眼角膜平铺片激光扫描共聚焦显微镜观察结果

3讨论

真菌性角膜病是严重致盲性眼病之一。调查结果[2]显示，近年来，该病在我国的发病率呈逐年上升趋势。由于治疗效果较差，致盲及致残率居高不下[11]。目前，研究者已经认识到真菌性角膜炎的发生主要由外伤(植物性占多数)、角膜手术、配戴接触镜和异物等原因造成角膜上皮组织的损伤和缺损，真菌可通过损伤和缺损部位侵入到角膜内生长繁殖，引起角膜组织的坏死以及炎症反应；但由于缺乏重复性及敏感性良好的哺乳动物模型，导致对该病的深入研究比较欠缺，许多基础研究以及应用基础研究尚属空白。建立理想的模拟人角膜真菌感染的动物模型已成为眼科基础及临床研究亟待解决的首要课题。

目前动物模型制作多采用兔或大鼠，均是非近交系动物；但近交系动物遗传的均质性和反应的一致性能使实验结果精准可靠，有利于真菌性角膜炎免疫学及分子水平的研究[12]，故该实验选择近交系C57BL/6小鼠建立动物模型。作者制作动物模型时用接种棒划破小鼠角膜上皮组织，仿真临床患者角膜的真菌感染自然过程，且不需应用免疫抑制剂，成功制作小鼠动物模型。用2 mm环钻进行角膜中央定位，使病变部位与周围组织对比明显，易于观察；用在真菌中培养的接种棒划痕模仿人角膜真菌感染的植物性外伤；接种后缝合眼睑，给接种真菌提供适宜生长的温度与湿度，且能减少泪液及瞬目对真菌的冲刷，为真菌黏附创建有利环境，并能避免环境污染，这些环节能有效提高模型的成功率。在角膜真菌感染过程中，角膜局部的免疫功能非常重要，但对机体进行免疫抑制会严重影响真菌性角膜炎的病程及炎症发展过程。与现有的动物模型相比，该研究制作的动物模型不需要对小鼠应用免疫抑制剂，真菌感染从角膜上皮破损面开始，真正仿真临床上真菌性角膜炎自然感染的过程，并且制作成功率高。模型判定时间点选择在中期以前进行，钙荧光白染色、Giemsa染色和真菌培养同时进行。实验中该模型临床表现和模型检测结果显示成功率为100%，为研究真菌性角膜炎病变发生发展的分子机制奠定了坚实基础。该研究结果显示了造模后由浅入深发展的自然病变进程，展现了真菌性角膜炎典型的临床症状，并经裂隙灯显微镜临床检查评分、角膜刮片及真菌培养证实了模型的稳定性和可靠性。但接种后缝合小鼠眼睑与临床真菌性角膜炎患者感染过程还存在差异，还需在接种方法上进一步改进。

在角膜建立真菌感染的前提是角膜存在上皮层的损伤和缺损，同时伴有真菌孢子或菌丝的种植。针对创伤的反应，首先进入感染角膜的炎症细胞是中性粒细胞[12-13]，它与临床上最常见的炎症性疾病发生与发展的细胞机制和分子机制关系密切，其功能和数量以及生存周期严重影响炎症的发生发展过程。角膜感染或创伤后形成的新生血管可导致视力显著下降，造成角膜疤痕，改变角膜的局部免疫状况，是角膜感染或创伤后最常见的特征之一[14-16]。该实验利用角膜平铺片技术在激光扫描共聚焦显微镜下，从角膜上皮层开始一直到内皮细胞层逐层观察了接种眼不同时期的中性粒细胞和新生血管变化，清楚地观察到中性粒细胞作为非常重要的初始免疫细胞向角膜中央溃疡灶动态迁移的过程，最终在病灶聚集、死亡；同时也观察到新生血管在炎症反应中的发生以及向病灶发展的过程，这与裂隙灯显微镜下相应时间点的临床检查及临床评分结果相符。上述结果也表明，在黄曲霉菌感染小鼠角膜的炎症反应和角膜组织破坏过程中，第5天是关键的时间窗；在时间窗前募集而来的中性粒细胞对于阻止微生物感染起着极其重要的作用，在时间窗后募集以及先前聚集的中性粒细胞在角膜真菌感染后炎症病灶的组织破坏中起关键作用。由此说明中性粒细胞向感染部位的迁徙是一把双刃剑，大量浸润的中性粒细胞造成角膜炎症组织的损伤甚至破坏。但病变部位募集的中性粒细胞的作用机制，以及它与真菌感染、组织破坏之间的关系是研究者需要深入探索的重点。

综上所述，不需要对宿主进行免疫抑制，用接种棒破坏角膜表面上皮组织，即可成功建立仿真临床真菌性角膜炎自然感染过程的小鼠模型。

参考文献

[1]Wang L,Sun S,Jing Y,et al.Spectrum of fungal keratitis in central China[J].Clin Experiment Ophthalmol,2009,37(8):763

[2]穆红梅,皮百木,李家臣,等.真菌性角膜炎的流行病学、临床和微生物学特征分析[J].眼科新进展,2013,33(9):879

[3]Abou Shousha M,Santos AR,Oechsler RA,et al.A novel rat contact lens model for Fusarium keratitis[J].Mol Vis,2013,19(12):2596

[4]Zhang H,Wang L,Li Z,et al.A novel murine model of Fusarium solani keratitis utilizing fluorescent labeled fungi[J].Exp Eye Res,2013,110(5):107

[5]Chandra J,Pearlman E,Ghannoum MA.Animal models to investigate fungal biofilm formation[J].Methods Mol Biol,2014,1147:141

[6]Taylor PR,Roy S,Leal SM,et al.Activation of neutrophils by autocrine IL-17A-IL-17RC interactions during fungal infection is regulated by IL-6, IL-23, RORγt and dectin-2[J].Nat Immunol,2014,15(2):143

[7]He S,Zhang H,Liu S,et al.γδ T cells regulate the expression of cytokines but not the manifestation of fungal keratitis[J].Exp Eye Res,2015,135(6):93

[8]Hiraoka T,Kaji Y,Wakabayashi T,et al.Comparison of micafungin and fluconazole for experimental Candida keratitis in rabbits[J].Cornea,2007,26(3):336

[9]Li Z,Burns AR,Rumbaut RE,et al.gamma delta T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion[J].Am J Pathol,2007,171(3):838

[10]Li Z,Burns AR,Smith CW.Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: distinct adhesion molecule requirements[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,47(5):1947

[11]Mimouni M,Tam G,Paitan Y,et al.Safety and efficacy of intrastromal injection of 5% natamycin in experimental fusarium keratitis[J].J Ocul Pharmacol Ther,2014,30(7):543

[12]Sun Y,Chandra J,Mukherjee P,et al.A murine model of contact lens-associated fusarium keratitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(3):1511

[13]Huang W,Ling S,Jia X,et al.Tacrolimus(FK506) suppresses TREM-1 expression at an early but not at a late stage in a murine model of fungal keratitis[J].PLoS One,2014,9(12):e114386

[14]Guo H,Gao J,Wu X.Toll-like receptor 2 siRNA suppresses corneal inflammation and attenuates Aspergillus fumigatus keratitis in rats[J].Immunol Cell Biol,2012,90(3):352

[15]Zeng P,Pi RB,Li P,et al.Fasudil hydrochloride, a potent ROCK inhibitor, inhibits corneal neovascularization after alkali burns in mice[J].Mol Vis,2015,21(6):688

[16]Sijnave D,Van Bergen T,Castermans K,et al.Inhibition of Rho-associated kinase prevents pathological wound healing and neovascularization after corneal trauma[J].Cornea,2015,34(9):1120

*河南省卫生科技创新型人才工程项目4120；河南省医学学术带头人出国培训计划项目201201053；河南省科技创新杰出人才计划资助项目104200510007；河南省卫生科技创新型人才工程科技领军人才基金20100304

Establishment of mouse aspergillus keratitis model and changes of mouse corneal histopathology

ZHANGWeihong1，2),JIANGLili1),WANGXiaokai1),ZHAOQiumin3),YANGDongbin2)，HUANGGuanfeng2),ZHANGHuanyun2),YANGYang2),LIANGFang4),HANLei5),WUXipi5)

1)SchoolofNursing，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)ThePeople’sHospitalofHebiCity,Hebi4580303)EditorialBoardofJournalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)TheAffiliatedZhengzhouCentralHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500525)InstituteofOphthalmologyofHenanProvince,Zhengzhou450003

Key wordskeratitis；aspergillus；mouse

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.024

中图分类号R772.21

通信作者#，男，1974年2月生，博士，在站博士后，研究方向：慢性病的基础与临床，E-mail：dongbinyang@126.com