张文博, 吴 闯

（辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部， 辽宁 抚顺 113001）

三氯甲烷对卤虫的急性毒性研究

张文博, 吴 闯

（辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部， 辽宁 抚顺 113001）

为评估三氯甲烷对水生生物的毒性影响，以美国大盐湖卤虫为受试生物，采用概率单位法研究了三氯甲烷对卤虫的急性毒性效应。结果表明：在25 ℃条件下，三氯甲烷对卤虫的24 h LC50为59.574 mg·L-1，95%置信限度：55.015～63.380 mg·L-1；48 h LC50为29.139 mg·L-1，95%置信限度：24.051～32.839 mg·L-1。培养48 h三氯甲烷对卤虫的致死作用比24 h显著增加，且48 h浓度响应范围也小于24 h响应范围。

三氯甲烷；卤虫；急性毒性

三氯甲烷又称氯仿，常温下为无色透明易挥发液体，是重要的有机合成原料，还广泛用作麻醉剂、溶剂和萃取剂，其在工业上的普遍应用使含三氯甲烷的污水排放对水环境造成污染，并且在水环境中很难被生物降解。三氯甲烷在地下水中有积蓄作用，其污染行为不仅体现在饮用水中，而且对食品及蔬菜也能造成污染。使用氯消毒的饮用水中游离氯与水中的有机物作用，形成以三氯甲烷为主的卤素化合物，其含量可达到对人体健康产生危害到处程度。三氯甲烷对人体有致畸、致癌性，对神经系统及内脏具有毒害作用，破坏敏感水生生物的呼吸系统[1]。在美国129种优先控制的污染物和中国58种环境优先监测和控制的有机物中，三氯甲烷均位于前列。因此，监测和评估三氯甲烷对水体的污染程度及其对水生生物的毒性影响也在日益受到关注。卤虫具有个体小、对环境变化敏感、可随时获得且易于保存和培养等优点，已被作为一种环境监测生物广泛用于水生生物毒理学研究中。本文以大盐湖卤虫为受试生物，研究三氯甲烷对卤虫的急性毒性，为三氯甲烷在水体环境中的监测提供实验依据及生物学参考。

1 实验部分

1.1 受试生物

以美国大盐湖卤虫（Artemia.francisana）作为受试生物，虫卵购自天津中盐制盐工程技术研究院。大盐湖卤虫卵具有孵化率和成活率比国产卤虫卵

高，且更易培养的优点。卤虫卵在光照培养箱中孵化，孵化条件为（25±1）℃，2 000 lux光照，光照时间比为12∶12（光照，黑暗），小型气泵充气搅拌。选取24 h内孵出的卤虫，转移至另外容器在相同的条件下继续培养24 h，得到Ⅱ～Ⅲ龄的卤虫无节幼体。试验前用标准物十二烷基硫酸钠（SDS）测得所孵化卤虫幼体24 h LC50为16.35 mg·L-1，符合ARC-test要求[2]，卤虫幼体可以作为受试材料。

1.2 试剂

三氯甲烷（色谱纯）购于天津康科德科技有限公司。

1.3 实验用水

实验用水采用人工海水，Ph=8.0±0.5，盐度（35 ±1）‰，其组成为： 23.70 g·L-1NaCl、0.54 g·L-1KCl、6.29 g·L-1MgSO4·7H2O、4.5g·L-1MgCl2·6H2O、0.15 g·L-1CaCl2、0.04 g·L-1NaHCO3和蒸馏水[3]。

1.4 预试验

在人工海水中按 0.1%加入三氯甲烷，超声波助溶，完全溶解后稀释成所需不同浓度。于50 mL小烧杯中加入25 mL三氯甲烷溶液，投入10只卤虫幼体，分为24 h组和48 h组，观察死亡情况，分别找出24 h 和48 h使全部卤虫未发生死亡的最高浓度和全部死亡的最低浓度，以确定试验所需浓度范围。

1.5 急性毒性试验

在300 mL烧杯中加入150 mL实验用三氯甲烷人工海水溶液，每只烧杯投入30只Ⅱ～Ⅲ龄的卤虫无节幼体。每个水平设置2个平行组，取平均值作为结果，同时设空白对照。在光照培养箱内恒温培养，（25±1）℃，2 000 lux光照，光照时间比为12∶12（光照，黑暗）。实验过程中不投饵不充气。分别于培养24 h和48 h记录各组卤虫死亡数量，在解剖镜下观察，以10 s内卤虫幼体附肢无明显运动作为死亡判断标准。用SPASS19.0进行数据分析，用概率单位法求出24 h LC50和48 h LC50。

2 结果与分析

2.1 预试验确定三氯甲烷浓度范围

表1 试验用三氯甲烷浓度Table 1 Concentration of chloroform in test mg·L-1

经过预试验，确定培养24 h和48 h三氯甲烷浓度范围分别如表1所示。各设置8个浓度组，在此浓度范围，死亡率介于 0～100%之间，且死亡率随浓度增加有明显增加。在预实验试验中，死亡率小于37%和大于63%的浓度组均大于一组，符合美国水生生物急性毒性试验的质量控制要求。

2.2 卤虫的中毒症状观察

试验中发现，卤虫中毒后有一段平稳期，泳动情况与对照组相比无异常，浓度越高这段平稳期越短。平稳期过后，泳动速度变慢，并逐渐沉入水底。从沉入水底至附肢停止摆动死亡经历的时间很短。

卤虫对三氯甲烷的中毒症状与其他物质的中毒症状类似，如柴油使卤虫活动能力下降，运动迟缓直至沉在水底不停颤动[4]；恩诺沙星也可以使卤虫出现运动迟缓，肢角摆动频率下降，趋光性变弱的现象[5]；而三氯甲烷同样使卤虫运动减缓，并且极大缩短了从沉入水底到死亡的时间，一旦沉入水底很快死亡。对比其他有机溶剂如丙酮和二甲基亚砜[6]，三氯甲烷对卤虫作用明显，或许是因为其对神经系统有麻醉作用的结果。但具体机理如何，尚未见明确报道。本试验采取的死亡判定方法为观察卤虫附肢10 s内不动即为死亡，与卤虫上述中毒特点相符，也符合水生生物急性毒性试验的质量控制要求，使得试验更加简单易行。这一点与有些报道所采用的针刺的方法有所不同[5]。

2.3 急性毒性试验结果

对照组死亡率为0，按此结果采用SPSS19.0软件进行分析，表2为用概率单位法计算24 h和48 h每组试验数据残差及相应的致死概率。其中浓度为取对数后的结果。由表2可知，24 h和48 h数据中，死亡率小于37%和大于63%均不低于3组，完全符合水生生物急性毒性试验的质量控制要求。

表3为经过回归计算后24 h和48 h各浓度预测值对应的死亡概率及其95%置信限度，为节省篇幅未全部列出。

表2 单元计数和残差Table 2 Cell count and residual

由表2中可以看出，两个时间组的死亡率均随浓度增加而上升，但在24 h组中，发生死亡的浓度范围较大，即随浓度的增加死亡率上升较慢；在48 h组中，发生死亡的浓度范围相对比较集中，即在该浓度范围内，死亡率随浓度增加迅速上升，卤虫对浓度的变化更为敏感。24 h卤虫幼体依靠自身卵黄囊内养分生活，一些器官仍处于发育中；48 h卤虫幼体卵黄囊养分已消耗完，开始转向从外部摄取食物。卤虫为滤食性动物，因此外部水环境与身体器官接触增加，也加剧了三氯甲烷的作用强度，这与本试验中48 h的LC50低于24 h LC50的结果相符。

表3 置信限度Table 3 Confidence limits

表 4为软件计算出的回归模型，Pearson 拟合度检验结果表明相关性显著，所以回归模型完全符合要求。24 h LC50为59.574 mg·L-1，95%置信限度：55.015～63.380 mg·L-1；48 h LC50为29.139 mg·L-1，95%置信限度：24.051～32.839 mg·L-1。

表4 三氯甲烷对卤虫幼体急性毒性效应Table 4 The acute toxicity of chloroform on Artemia.francisana

三氯甲烷的毒性研究结果多见于人和模式动物如小鼠、大鼠[1]，对于水生生物的毒性及危害研究较少。卤虫作为受试生物已经被广泛的应用于水环境污染物的毒性评价和生态毒理学的研究[7]，如评估钻井液[8]、重金属离子[9]、农药[3]等有毒物质及某些藻类[10]的生物毒性。有研究表明，三氯甲烷对盐藻的48 h半数有效抑制浓度EC50为1.17 µmol·L-1[11]；对斑马鱼的24 h LC50为141 mg·L-1，48 h LC50为129 mg·L-1；浓度为5 mg时可引起大银鱼幼体发生畸形，畸形率为20%[12]；对水螅的中毒浓度为318 mg·L-1，再生生长抑制浓度为120 mg·L-1[13]。同以上水生生物相比，卤虫对三氯甲烷响应浓度更低，更适于用来进行生物监测。

2.4 试验的质量保证

市售三氯甲烷分析纯试剂一般为防止遇光照或与空气中的氧作用，逐渐分解而生成剧毒的光气(碳酰氯)和氯化氢，通常加入0.6%～1%的乙醇作为稳定剂。为保证试验结果的准确，本试验中在预试验和正式试验中均采用色谱纯三氯甲烷，纯度更高，可直接用于试验而无需再次标定。目前一些文献中的进行的三氯甲烷毒性研究，并未排除乙醇对试验生物的影响，因此对其毒性的评价与纯三氯甲烷相比是有区别的。

本试验采用 SPSS19.0软件对数据进行分析处理，它和SAS、BMDP并称为国际上最有影响的三大统计软件。在国际学术交流中，凡是用 SPSS软件完成的计算和统计分析，可以不必说明算法，其统计结果被国际同行广泛认可。该软件能根据回归模型，直接计算出从1%至99%各浓度对应的响应概率，并给出95%置信限度，有利于进行半致死浓度研究。

3 结 论

三氯甲烷对卤虫的24 h LC50为59.574 mg·L-1，95%置信限度：55.015～63.380 mg·L-1；48 h LC50为29.139 mg·L-1，95%置信限度：24.051～32.839 mg·L-1。卤虫对三氯甲烷浓度变化敏感，可以用于对其进行生物监测。中毒48 h对应的死亡浓度范围小于中毒24 h对应浓度范围，且三氯甲烷中毒症状与已报道的一些有机物中毒症状有相似之处，具体机理有待进一步研究。

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Study on Acute Toxicity of Chloroform on Artemia.francisana

ZHANG Wen-bo，WU Chuang
（College of Chemistry, Chemical Engineering and Environmental Engineering, Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001，China）

For evaluating the toxicity of chloroform on aquatic organism, Artemia.francisana was used as test organism to study the acute toxicity of chloroform by probit method. The results show that, at 25 ℃, the 24 h LC50is 59.574 mg·L-1, and its 95% confidence limit is 55.015～63.380 mg·L-1; the 48 h LC50is 29.139 mg·L-1, and its 95% confidence limit is 24.051～32.839 mg·L-1. The lethal effect of chloroform after 48h culture is more significant than that of 24 h, and the concentration response range is also the same.

Chloroform; Artemia.francisana; Acute toxicity

X 835

A

1671-0460（2015）09-2264-04

2015-08-06

张文博（1994-），男，辽宁沈阳人，研究方向：生物化工。E-mail：zhangwbbio@sina.com。

吴闯（1973-），男，硕士，研究方向：生物工程。E-mail：wuchuang2000@sina.com。