李孜孜 周璇

术中快速冷冻切片制作相关问题探讨

李孜孜 周璇

本文通过对取材、切片、染色、封片各个环节的分析, 阐述容易出现的问题及对策。通过针对不同组织切片对策的调整, 制作出优质的冰冻切片。制作术中冷冻切片的制作是一项需要谨慎的态度和高超的技巧的工作, 需要病理技术人员长期的练习和摸索, 并在实际工作中针对不同组织的特点采用不同的制片方式, 不断总结经验发现问题及解决问题。

冷冻切片；制片

快速冷冻切片是新鲜组织不经过任何脱水处理, 通过冷冻包埋剂的支持硬化, 直接在低温恒冷切片机冷冻后立即进行组织切片。未经过固定的组织着色迅速, 色彩鲜艳, 并最大程度的保存了组织中酶的活性, 在临床和科研中应用广泛。在临床工作中, 由于冷冻切片制片时间短, 能在30～40 min内为临床医师对患者制定手术治疗方案提供依据, 而常规石蜡切片的活体组织病理学诊断报告一般用于收到送检标本后的3～5个工作日才能发出, 在外科手术中得以广泛的应用,因此医院的病理科冷冻切片的发展水平对于外科的发展起到了很大的支持作用［1］。但由于快速冷冻切片的组织未经过固定, 形态和常规石蜡切片具有一定的差异, 所以该方法具有一定的局限性, 一些疑难病例的诊断和对肿瘤的进一步分类,需要待石蜡切片结果而定。快速冷冻制片由于制作时间短,要求在15 min之内, 因此对病理技术人员的技术及标本的取材、快速冷冻切片机的温度、包埋剂的支持硬化、防卷板的调试都有极高的要求。

1 材料与方法

1.1 一般材料 手术送检皮肤、甲状腺、胃肠、乳腺、淋巴结、子宫、卵巢、肺、前列腺、脑等组织, 所有组织均新鲜切除并不加任何处理。

1.2 试剂 普通胶水; AF混合固定液(95%乙醇90 ml、40%甲醛10 ml)、苏木素染色液、水溶性伊红及梯度乙醇、二甲苯。

1.3 设备及器材 德国产Le ica-CM1900型恒冷切片机, 预先调至-22～-20℃；日本产Feather一次性刀片。

1.4 方法

1.4.1 取材 将手术送检的组织按常规取材, 取材砧板保持干净避免污染, 一般组织块的大小为1.5 cm×1.5 cm ×(0.4～0.6 cm)。取材比常规石蜡活检组织略厚, 取材时避开脂肪及坏死出血区, 尽量剔除脂肪、毛发、硬骨或钙化, 取材时注意干燥, 小组织用干纱布托住, 以防脱落。由于取材的块数有限, 因此要求取材人员仔细检查标本, 针对病变区域重点取材。

1.4.2 包埋 将取好材块最利于诊断切片向上, 放置于金属冰托上, 冰托无需提前冷藏, 再放入冷冻切片机内,加胶水, 待冻结后, 并在周围补以适当胶水。对穿刺或较小的组织标本, 先放少许胶水于切片托上做一冰台, 垫高后再放小块组织进一步冰冻后再切。待组织周围胶水完全凝固之后, 将冷冻锤轻压在组织表面, 使组织和周围的支撑剂平整。

相关文献建议各种组织冰冻温度如下：甲状腺-20～-18℃；含脂肪的乳腺-30～-22℃；脂肪组织-30℃以下；脑-18～-16℃；肝、脾、肾、淋巴结-18℃；皮肤、肌肉-24～-22℃；卵巢、胆囊、胃壁-22～-20℃。在实际工作中, 由于白天术中冰冻标本较密集, 频繁调试切片机的温度不实际, 故一般在室温20℃以上时将冷冻切片机机箱温度调至-25℃, 在室温低于20℃时将冷冻切片机机箱温度调至-20℃［2,3］。

1.4.3 切片 将金属冰托夹至样品夹, 缓慢倒退至合适距离开始修片, 修片不可进刀幅度太大, 会使留片时刀头前进不均匀, 切片上产生横纹。留片时均匀转动转轮, 适当调整防卷板的位置, 留片厚度4～6 µm。

1.4.4 染色 将已固定的切片用风筒吹干用流水冲洗后,先放入AF固定液固定1 min, 然后放入苏木素染色液中染0.5～1.0 min, 取出水洗数秒, 用体积分数1%盐酸乙醇分化,水洗后放入40～60℃体积分数10%氨水中蓝化。然后置入伊红液染10 s, 水洗。体积分数80%～100% 梯度乙醇脱水至二甲苯, 封固。

2 结果

经过上述处理, 切片平整、厚薄均匀、无皱褶、细胞核呈蓝色, 细胞质呈红色, 对比鲜艳清晰, 细胞无肿胀、无收缩,切片无冰晶, 与常规石蜡切片基本无差别。

3 容易出现的相关问题及对策

3.1 取材 冰托清理干净残留胶水, 定期用消毒试剂浸泡,晾干备用；含水或血分较多组织容易产生冰晶不利于切出完整切片, 在取材时应用擦镜纸吸取水分和血迹：取材时尽量避免脂肪和坏死组织；取材大小厚度适中, 组织块太小不利于诊断、太大留片困难, 太厚冷冻时间长；取材时要特别留意细钉子和骨组织, 以免对切片机造成损坏［5,6］。

3.2 包埋 包埋时冰托不需预先冷冻, 避免冷冻剂和冰托由于温差太大不能紧密结合；包埋用胶水要完全包裹组织。

3.3 切片 切片过程中根据组织不同的特点调整切片策略。①甲状腺等组织可能由于冰冻时间过长产生碎片或条索状,可以用拇指轻轻按压组织数秒, 使组织块温度略升高再继续留片。②乳腺等含脂肪含量较多的组织, 留片困难时可以适当增加切片厚度。③组织块较小或病变区域较小时,修片幅度要小, 靠近所需区域时应用转动转轮继续修片, 直至最大面然后留片。④皮肤组织皮面向上切片。⑤切片皱在一起, 不能完整出片, 适当调整防卷板和刀口的位置。⑥切片一截厚一截薄, 呈阶梯状, 这是由于组织过硬(如子宫肌瘤、宫颈或乳腺纤维腺瘤), 或由于切片机样品夹头和刀座上的螺丝没有拧紧。⑦切片出现筛状空洞时, 是由于组织块较硬修片进刀幅度较大, 可继续转动转轮使组织块上白点消失再留片。

3.4 染色 ①固定时间要充足, 固定液要经常更换, 固定不充分的组织尤其是细胞成分较多, 组织在镜下观察时会出现流水样改变。②染色不鲜明, 细胞浆细胞核不分明时, 要立即更换苏木素和伊红。③染色之前切片一定要用风筒吹干,否则易脱片。

3.5 封片 ①封片时的切片要充分干燥, 未充分干燥的切片镜下呈水雾状。②封片用树脂浓度适宜, 利于将组织完全封固。

3. 6 冰余和冰对的处置 ①冰余在冰冻结果上报至手术医生之后立即用福尔马林固定, 避免时间太久组织自溶。②冰对可贴上病理号, 避免标本混淆, 置于冰冻机中, 当天不取材的冰余表面应用胶水封固。

综上所述, 制作术中冷冻切片的制作是一项需要谨慎的态度和高超的技巧的工作, 需要病理技术人员长期的练习和摸索, 并在实际工作中针对不同组织的特点采用不同的制片方式, 不断总结经验发现问题及解决问题。这不仅体现了一名医务者精益求精的态度更体现了一名医务工作者的责任心。只有通过这样不断的努力和钻研才能制作出精良的术中病理切片, 为病理诊断提供保障。

［1］ 邴鲁军, 高英茂, 郭雨霁, 等.冷冻切片常遇到的问题及解决对策. 医学信息.2006(9):1631-1633.

［2］ 陈乐真, 于占洋. 提高冷冻切片诊断准确性的经验和体会.中华病理学杂志.2000(2):59-61.

［3］ 董愉, 梁英杰, 吴惠群, 等. 不同固定液对不同组织冷冻切片HE染色效果的探讨.临床医学工程.2011(10):1584-1585.

［4］ 许平, 王筱璨, 陈奎生, 等. 快速冰冻切片制备方法的改进.郑州大学学报(医学版).2010.45(2):241-243.

［5］ 刘晓兰, 刘燕, 宋月晗, 等. 冰冻切片制作体会及常见问题.现代生物医学进展.2010.10(14):2737-2741.

［6］ 凌启波, 梁英杰. HE制片质控要求.临床与实验病理学杂志.2000.16(4):333-334.

Investigation of related issues of making fast freezing microtome section in operation

LI Zi-zi, ZHOU Xuan.
The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuha.519000, China

In this paper, problems and solutions were elaborated through the analysis of materials, sectioning, staining, and mounting. Quality frozen section was made through adjustment of different tissue slicing strategies. Making fast freezing microtome section in operation requires cautious attitude and excellent skill. Pathological technical staff needs long-term exercise and exploration, and they ought to take various making methods for different tissues with specific characteristics. It is necessary for them to summarize working experience for finding and solving questions.

Freezing microtome section; Section making

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.01.164

2014-09-01］

519000 中山大学附属第五医院