齐红双　薛士鹏　李英　马敬花　杨瀚

多重PCR技术在诊断南阳地区志贺菌引起的腹泻患者中的应用

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目的 研究多重PCR技术在对南阳地区志贺菌感染导致腹泻的诊断及血清分型中的应用。方法 收集医院腹泻患者粪便，进行分离培养、生化鉴定和血清学分型，将初筛的志贺菌通过多重PCR技术对毒素基因shetA、shetB、 ial和ipaH进行扩增检测。结果 结合临床症状和生化鉴定初筛的志贺菌共有83株，血清学鉴定为福氏志贺菌的有50株，宋内志贺菌28株，鲍氏志4株，痢疾志贺菌1株。通过多重PCR对取得的83株志贺菌进行扩增后在423bp（ipaH）处出现了条带，与常规方法鉴定得到的结果一致。结论 南阳地区细菌性痢疾感染者以福氏志贺菌为主要感染菌，多重PCR技术能够快速、简便、特异敏感地对志贺菌进行检测。

志贺菌；PCR；检测；诊断；分型

志贺菌（shigellosis）又称痢疾杆菌，是引起人类细菌性腹泻的主要病因之一，感染人体后通过侵犯小肠黏膜上皮细胞，使上皮细胞变性坏死，从而引起腹泻。根据抗原结构和生化反应的不同可分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内志贺菌。长期以来，传统的分离培养技术在对痢疾的诊断中发挥了重要的作用，检测至少要48 h且步骤繁琐，还存在许多难以控制的客观因素。容易产生误诊和漏诊，会延误疾病治疗的最佳时机。本研究通过多重PCR技术对南阳地区腹泻患者粪便中扩增痢疾的侵袭性基因（ipaH）［1］及相关的基因位点（ial），将为临床快速准确地诊断志贺菌提供理论基础，并且可以避免许多不可控因素。

1　材料与方法

1.1材料

83株志贺菌都是在2014～2015年从南阳南石医院及南阳医学高等专科学校第一附属医院收集的腹泻患者的黏液脓血便标本，然后进行分离鉴定。所用培养基、生化反应试剂、志贺菌诊断血清购于郑州生物科技公司。

1.2方法

1.2.1将从本院及周边医院收集到的黏液脓血便标本接种在SS和MacoConkey培养基上分离培养，37℃ 24 h后取可疑菌落转种到KIA和MIU培养基上进行生化鉴定。直接用全自动细菌鉴定仪进行鉴定，最终通过玻片凝集进行血清型鉴定。

1.2.2多重PCR检测 将鉴定过的志贺菌过夜培养18～24 h，再取100 μl培养菌液，3 000 r/min离心后弃上清再加50 μl去离子水，沸水煮10 min后5 000 r/min离心，取上清液为PC R模板。设计引物如下setlA：P1-TCA CGC TAC CAT CAA AGA P2-TAT CCC CCT TTG GTG GTA，setlB：P3 GTG AAC CTG CTG CCG ATA TC P4 ATT TGT GGA TAA AAA TGA CG，ial：P5-CTG GAT GGT ATGGTG AGG，P6-GGA GGC CAA CAA TTA TTT CC，ipaH：P7-TGG AAA AAC TCA GTG CCT CT，P8-CCAGTCCGT AAA TTCATT CT。反应体系为如下：buffer（Mg+） 5 μl，模板各为2 μl，引物各1 μl。反应条件为：95℃ 4 min，94℃变性60 s，55℃退火60 s，最后72℃延伸8 min，共循环35次。同时设阴性对照。凡出现了423 bp的条带外，再出现309 bp（setlA基因）、147 bp（setlB基因）以及320 byGal基因中任意一个出现条带，均为阳性。

2　结果

2.1样本收集结果

通过分离培养和生化鉴定，我们共得到83株志贺菌，然后再通过玻片凝集进行血清型鉴定，我们鉴定出来共有福氏志贺菌50株，宋内志贺菌28株，鲍氏志贺菌4株，痢疾志贺菌1株。

2.2多重PCR检测结果

通过多重PCR扩增后，我们鉴定的83株志贺菌均在423 bp处出现了条带，其余的在147，309，320 bp处均出现了至少一个条带，与常规鉴定法一致。

3　讨论

通过调查发现，福氏志贺菌是我市引起腹泻的主要菌群，与国内其他地区的报道相一致［2］。志贺菌和一些肠杆菌科细菌生长和生化特性非常相近，所引起细菌性腹泻的临床症状也很难区分。所以对其病原学的诊断就显得尤为重要了，本研究采用多重PCR对志贺菌进行检测。多重PCR的特点是快速、高敏感性、高特异性，已经被国外的学者［3］用于细菌性腹泻的检测，尤其是对标本的量较少或者经过药物治疗后活菌量不多的标本。

对志贺菌的致病性和基因型我们已经基本阐明，选取ipaH、ial、shetA、和shetB基因作为目的基因是因为Buysse［4］等发现各型志贺菌都有ipaH的存在，不会随传代而丢失，所以被认为是志贺菌的管家基因。单用ipaH基因PCR结果阳性并不一定发病，多是痢疾杆菌携带者。侵袭相关基因ial存在于侵袭性大质粒上一个2.5 kb侵袭相关区段中，是志贺菌的毒力基因，由两种志贺菌肠毒素shetA，shetB编码基因。菌痢患者除了ipaH基因阳性外，ial或hetA、hetB基因检测同时阳性，才能证明是痢疾杆菌感染，且具有致病性。

本研究对分离出的83例腹泻标本进行多重PCR鉴定，像普通的PCR一样，只是在PCR体系中多增加了几对引物，反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同，却又表现出了PCR法的高特异性。检验过程用时短，快速准确，是一种较为理想可靠的检测志贺菌的方法。

［1］Schroeder GN，Hilbi H. Molecular pathogenesis of Shigella spp：controlling host cell signaling，invasion，and death by typeⅢ secretion［J］. Clin Micmbiol Rev.，2008，21（1）：134-156.

［2］李颐，罗蓓，胡雪明，等. 上海市静安区2005-2008年分离到的志贺菌血清型分布及耐药性分析［J］. 现代预防医学，2011，38（15）：3089-3090，3094.

［3］李小丽，阴赪宏，温艳，等. PCR快速检测腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial［J］. 世界华人消化杂志，2007，15 （19）：2128-2132.

［4］Phantouamath B，Sithivong N，Insisiengmay S，et al. Pathogerticity of Shigella in healthy carvers: a study in Vientiane， Lao People， Democratic Republic［J］. Jpn J Infect Dis.，2005，58（4）：232-234.

Application of Multiplex PCR Technique in the Diagnosis of Diarrhea Caused by Shigella in Nanyang Area

QI Hongshuang1XUE Shipeng2LI Ying1MA Jinghua1YANG Han1， 1 Department of clinical laboratory， Nanyang Nanshi hospital， Nanyang 473000， China， 2 Nanyang Medical College， Nanyang 473000， China

Objective The study of multiple PRC technology in the diagnosis of diarrhea caused by shigella infection in Nanyang area and the application of serum typing. Methods The feces of patients with diarrhea in hospital were collected and cultured， biochemical identification and serological typing. The， ial， shetB and shetA of ipaH were amplified by multiple PCR. Results Combined with clinical symptoms and biochemical screening of shigella in a total of 83 strains， serological identification of shigella flexneri has 50 strains， 28 strains of shigella sonnei， bao s boydii 4 strains， shigella dysenteriae 1 strain. The 423bp （ipaH） was amplified by multiplex PCR， and the results were consistent with the conventional method. Conclusion Shigella dysentery infection in Nanyang area is mainly infected by shigella， and multiplex PCR technology can quickly， easily and specifically sensitive to detection.

Shigella， PCR， Detection， Diagnosis， Typing

R378

A

1674-9308（2015）33-0038-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.33.025

1 473000 南阳南石医院检验科；2 473000 南阳医学高等专科学校