张亘，黄燕红，李静

（1.抚顺矿务局总医院普外科，辽宁抚顺113008；2.中国医科大学附属第一医院内分泌科，中国医科大学内分泌研究所，沈阳110001）

磷酸化P53与ERα在乳头状甲状腺癌中的相关性研究

张亘1，黄燕红2，李静2

（1.抚顺矿务局总医院普外科，辽宁抚顺113008；2.中国医科大学附属第一医院内分泌科，中国医科大学内分泌研究所，沈阳110001）

目的 探讨磷酸化P53［p-P53（Ser 6）］与雌激素受体（ER）α在乳头状甲状腺癌（PTC）中的表达及其相关性。方法应用免疫组织化学Elivision plus二步法检测p-P53（Ser 6）、突变P53（mut-p53）、ERα在34例生育期女性乳头状甲状腺癌组织石蜡切片中的表达，并进一步分析p-P53（Ser 6）与ERα表达的相关性。结果生育期女性的PTC组织中均有p-P53（Ser 6）的的表达，阳性率为100%，表现为细胞核或细胞核/质阳性染色，其表达与mut-P53的检测结果有明显不同。生育期女性PTC组织中p-P53（Ser6）的表达水平与ERα呈显著正相关（r=0.334，P=0.053），而mut-P53的表达水平与ERα表达无相关（r=-0.078，P=0.661）。结论p-P53（Ser6）与ERα的表达呈显著正相关，提示P53磷酸化可能参与促进了生育期女性PTC的发生、发展。

磷酸化P53；雌激素受体α；乳头状甲状腺癌；免疫组化

乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤，起病较隐匿，临床表现及生物学特征复杂多变，且具有较高的局部侵袭性和颈部淋巴结转移率。流行病学研究发现PTC在我国的发病率逐年增加，且主要为青中年女性高发。近年来的研究表明，P53基因是重要的肿瘤抑制基因，其表达的蛋白质可分为野生型（wild type P53，wt-P53）和突变型（mutant P53，mut-P53）。野生型为肿瘤抑制因子，其突变型可抑制野生型的功能，加速癌症进程，提示P53与多种肿瘤的生物学行为有关。前期研究结果显示，甲状腺癌组织中雌激素受体（estrogen receptor，ER）亚型α的表达可促进PTC的发生和发展［1］。本研究拟应用免疫组织化学Elivision™plus二步法检测磷酸化P53（phosphorylated P53，p-P53）、ERα在34例PTC的表达，并进一步分析p-P53与ERα的相关性，探讨其在PTC发生、发展中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取我院病理科2007年至2010年临床资料完整的PTC存档蜡块34例（不包括微小癌）。均为生育期女性，年龄（32.62±8.74）岁。PTC患者首诊和治疗均在我院，病程3年内手术治疗。无颈部放射史，无甲状腺癌家族史。通过查阅我院病案室病志，获取患者的性别、年龄等相关临床资料。

1.2 主要试剂及染色方法

免疫组化染色采取改良的ElivisionTMplus二步法。一抗分别为兔源性抗p-P53（Ser 6）抗体（英国Abcam公司，稀释度1∶350）、兔源性抗mut-P53抗体（北京博奥森生物技术公司，稀释度1∶350）、鼠源性抗ERα单克隆抗体（丹麦Dako公司，稀释度1∶200）。ElivisionTMplus试剂盒、DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。

取厚度4 μm的甲醛固定、石蜡包埋组织切片，常规二甲苯和梯度乙醇脱蜡脱苯，92～98℃枸橼酸钠溶液抗原热修复，冷却后去离子水冲洗。3%H2O2室温孵育10 min封闭内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，加入一抗4℃过夜。PBS-Tween 20冲洗后，先后加入ElivisionTMplus试剂盒中的试剂A和试剂B。最后DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察有无表达及表达强弱评分和亚细胞定位。

1.3 结果判定

采用Allred score方法［2，3］。具体如下：PS为甲状腺细胞的表达比例（0，不表达；1，＜1/100；2，1/100～1/10；3，1/10～1/3；4，1/3～2/3；5，＞2/3），IS为甲状腺细胞的表达强度（0，不表达；1，弱；2，中；3，强），表达评分TS=PS＋IS，0～2分为不表达，≥3分为表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。阳性率比较采用χ2检验，表达评分采用非参数Mann-Whitney U检验和Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p-P53（Ser 6）与mut-P53的阳性率、表达水平及亚细胞定位

生育期女性的PTC组织中p-P53（Ser 6）的阳性率为100%，mut-P53的阳性率为70.6%，二者比较差异有统计学意义（P＜0.01）。p-P53（Ser 6）与mut-P53的亚细胞定位表达差异有统计学意义（P＜0.001），而表达评分比较无统计学差异。见表1，图1。

2.2 生育期女性PTC组织中p-P53（Ser 6）、mut-P53与ERα表达评分的相关分析

统计学分析结果显示：生育期女性PTC组织中，p-P53（Ser 6）的表达水平与ERα呈明显正相关（r= 0.334，P=0.053，图1），尤其是p-P53（Ser6）在细胞核与细胞质均表达以及仅在细胞质中表达时（r= 0.522，P=0.018），而细胞核中表达的p-P53（Ser 6）与ERα的表达水平无显著的相关性（r=0.135，P= 0.646）。而mut-P53的表达水平与ERα无相关（r=-0.078，P=0.661，图1）。

3 讨论

P53基因是最早发现的肿瘤相关基因之一，也是目前发现的与肿瘤相关性最高的基因之一，有“分子警察”之称。P53基因分为野生型和突变型2种，其产物也有野生型和突变型。正常细胞内的P53基因为野生型，它可以阻止受损的DNA重新复制，且对细胞增生有负调节作用，是一种抑癌基因，对维持细胞的正常生长和抑制细胞的恶性增殖过程起着重要作用。但P53基因的失活及突变是众多肿瘤的启动因素。

P53基因突变是人类恶性肿瘤发生的最常见基因突变之一，其突变和异常表达几乎见于人类所有的肿瘤中，在人类癌症中发生突变的频率可高达50%以上。P53基因突变后即具有癌基因的作用，可能引起甲状腺癌变，并使其向低分化甲状腺癌转化，伴有P53突变的PTC恶性程度常偏高。已有研究证实，mut-P53蛋白的表达与多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后相关［4，5］。在甲状腺恶性肿瘤中，P53基因改变主要表现为点突变、缺失和插入，这些基因改变主要位于第5～8号外显子中，且95%以上为点突变，所形成的mut-P53不但失去了wt-P53的抑癌功能，而且还获得了一系列类似于癌基因的功能，促进了肿瘤的进程。在癌症发生过程中，通常是P53的一个等位基因发生突变，另一个保持wt-P53活性，这时在细胞内同时存在mut-P53和wt-P53 2种蛋白单体，mut-P53抑制wt-P53活性，占据主导地位。一般来说，P53发生突变后，会丧失wt -P53所具有的细胞周期阻滞、介导细胞衰老、诱导凋亡发生等抑癌基因功能，与此同时，mut-P53获得了一系列类似癌基因特性的功能，如转录一系列靶基因加速癌症进程、增强癌细胞化学耐药性、阻止癌细胞凋亡的发生等［6］。据报道，mut-P53在PTC中的表达可高达76%，可为甲状腺癌的分化、诊断及转归判断等提供客观依据［7～9］。这也与本研究对PTC组织中mut-P53的检测结果一致，但是关于该病变中p-P53的研究至今鲜有报道。

wt-P53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟，而mut-P53蛋白稳定性增加，半衰期延长，可被免疫组化方法检测出来。但已有研究发现，P53蛋白经磷酸化修饰后，其稳定性明显增高，也可被免疫组化方法检测出来。而且突变型与野生型P53蛋白均可被磷酸化，这种磷酸化进一步有助于mut-P53的稳定。Melnikova等［10］发现，虽然过量表达的鼠双微染色体2（murine double minute 2，MDM2；人同源蛋白为HDM2）可以降低P53蛋白的含量，但是却不能降低磷酸化后的mut-P53含量，提示磷酸化不但可以维持这种促进细胞增殖失控的突变蛋白在核中的积累，而且还增强了它的致癌能力。P53可在多部位被磷酸化。Minamoto等［11］比较了肿瘤和正常细胞中P53的磷酸化修饰位点，发现并不一致，提示可能因为修饰位点不一样造成了功能不同。最近的研究发现，在N端（ser6/ser9）被Raf/ras/MAPK/ERK1/2信号通路磷酸化的P53是调节及整合Raf/ras/MAPK/ ERK1/2介导的促增殖、生长作用与转化生长因子β（transforming growth factor，TGF-β）/Smad介导的抑制细胞增殖作用的关键节点［12］。P53这种磷酸化形式与后继的TGF-β信号Smad转录因子生理学上有密切的相关性，改变基因的表达程序，导致TGF-β不能发挥其抑制增殖的作用，可促进肿瘤生长［12］。而在PTC中除了抑癌基因P53突变所产生的影响外，还有较为公认的癌基因Braf突变［13］。Braf是raf蛋白中最主要的活性形式，突变后的Braf活性持续增强，使Raf/ras/MAPK/ERK1/2介导的信号通路异常活化，除了进一步促进增殖作用外，还可能进一步促进磷酸化的P53表达增多［13］。

本研究结果发现，生育期女性的PTC组织中p-P53（Ser6）表达的阳性率（100%）显著高于mut-P53（70.6%），进一步提示磷酸化修饰可提高P53稳定性，参与促进PTC的发生、发展。本研究还发现，生育期女性PTC患者中p-P53（Ser6）的表达水平与ER α呈显著正相关，尤其p-P53（Ser6）在细胞核与细胞质中均表达以及仅在细胞质中表达时，提示滞留于细胞质中的p-P53可能通过与ERα的相互作用而促进PTC的发生、发展。在结直肠癌中的研究已显示，P53滞留于细胞质中、缺乏核转位的一个重要原因是由于基因突变所致［14］。

综上所述，p-P53在生育期女性PTC中高度表达，并与ERα的表达呈明显正相关，从而可能参与促进了PTC的发生、发展。因此，在PTC的病理诊断中，mut-P53及p-P53的表达检测均可作为临床辅助诊断、评价甲状腺癌生物学行为的重要指标，对临床诊治及预后具有重要的指导意义。

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（编辑 王又冬）

Correlation between Phosphorylated P53 Protein and Estrogen Receptor α Expression in Papillary Thyroid Cancer

ZHANGGen1，HUANG Yan-hong2，LI Jing2
（1.Department of General Surgery，the General Hospital of the Mining Bureau ofFushun，Fushun 113008，China；2.Department of Endocrinology and Metabolism，Institute of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between phosphorylated P53 protein and estrogen receptor（ER）α expressions in papillary thyroid cancer（PTC）.MethodsImmunohistochemical staining was performed on thyroid tissue sections to detect phosphorylated P53［p-P53（Ser6）］，mutant P53（mut-P53），ERα protein expressions in the female PTC patients of reproductive age（n=34）by Elivision™plus two-step system.The relationship between p-P53（Ser6）and ERα expressions was further analyzed.ResultsThe expression of p-P53（Ser6）was found in all the samples of PTC lesions from the female patients of reproductive age（n=34），which exhibited either combined nuclear and cytoplasmic staining or exclusively nuclear localization.The expression pattern of p-P53（Ser6）was significantly different from that of mut-P53.In female PTC patients of reproductive age，p-P53（Ser6）expression was positively correlated with that of ERα（r=0.334，P=0.053），while no correlation was found with the mut-P53 expression（r=-0.078，P=0.661）.ConclusionThe correlation between p-P53（Ser6）and ERα expression indicates that the phosphorylation of P53 may play an important role in PTC development in females of reproductive age.

phosphorylated P53；estrogen receptor α；papillary thyroid cancer；immunohistochemistry

R736

A

0258-4646（2015）01-0051-04

辽宁省高等学校优秀人才支持计划（LJQ2011080）；辽宁省科技攻关层次计划（JH2）项目（2008225007）

张亘（1967-），男，副主任医师，硕士.

李静，E-mail：lijingendocrine@126.com

2014-10-19

网络出版时间：