崔守斌，姜英，武昕

（1.中国医科大学附属第一医院妇科，沈阳110001；2.滨州医学院烟台附属医院妇产科，山东烟台264100）

丝切蛋白1及前纤维蛋白1在外阴鳞状细胞癌中的表达及意义

崔守斌1，2，姜英1，武昕1

（1.中国医科大学附属第一医院妇科，沈阳110001；2.滨州医学院烟台附属医院妇产科，山东烟台264100）

目的 探究丝切蛋白1（CFL1）及前纤维蛋白1（PFN1）在外阴鳞状细胞癌（VSCC）中的表达与意义。方法采用免疫组化和免疫印迹方法检测CFL1及PFN1在VSCC中的表达及其与临床病理资料相关性。结果CFL1在VSCC中的表达显著高于外阴的正常皮肤（P＜0.05）；临床Ⅲ期的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）；在低分化、中分化的VSCC中的表达明显高于高分化VSCC（P＜0.05）；伴淋巴结转移的表达明显高于无淋巴结转移（P＜0.05）。PFN1在VSCC中的表达显著高于外阴的正常皮肤（P＜0.05）；临床Ⅲ期的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）；伴淋巴结转移的表达明显高于无淋巴结转移（P＜0.05）；VSCC低、中分化和高分化之间没有统计学差异（P＞0.05）。Pearson相关性分析结果表明：CFL1及PFN1在VSCC中的表达呈正相关（r2= 0.753，P＜0.001）。结论CFL1及PFN1的表达与VSCC的发生和发展有关。

丝切蛋白1；前纤维蛋白1；外阴鳞状细胞癌；免疫组化；免疫印迹

外阴恶性肿瘤约90%以上为外阴鳞状细胞癌（vulvar squamous cell carcinoma，VSCC），常见于60岁以上的绝经后妇女，其5年生存率为58.9%～68.9%，目前病因尚不十分清楚。

丝切蛋白1（cofilin-l，CFL1）作为丝切蛋白的2个亚型之一，是一种分子量约为21 kDa的肌动蛋白结合蛋白（actin binding protein，ABP），基因存在于染色体11q13上，正常表达于真核生物多种非肌肉组织，尤其是脑和肝中高表达，在调控细胞运动方面起重要作用［1］，目前研究发现CFL1在肺癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌［2］中呈高表达，与肿瘤的生长、迁移、侵袭密切相关［3］。前纤维蛋白1（profilin-1，PFN1）也被称为细胞骨架蛋白结合蛋白1，也是ABP的一种，作为前纤维蛋白家族的一个成员，分子量约为12～15 kDa，基因定位于17p13.3，于真核生物细胞中普遍存在，参与调节肌动蛋白骨架重塑，细胞形态的维持、细胞黏附、运动、生长、分裂以及其配体依赖的信号转导等多种生物学功能［4］。研究发现PFN1在一些癌中低表达，如乳腺癌、胰腺癌［5］、膀胱癌［6］、鼻咽癌、肝癌等，在另一些癌中高表达，如胃癌、肾癌［7］等。CFL1及PFN1在VSCC中表达如何，与VSCC发生发展是否有关尚不清楚。因此，本研究通过免疫组化法（SP法）和Western blot方法检测CFL1及PFN1在VSCC中的表达情况，探讨其与VSCC的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：选自中国医科大学第一附属医院2003年6月至2013年6月35例住院VSCC患者；外阴整形手术中去除正常外阴皮肤组织的20例患者，选取的组织用10%的甲醛固定，制成石蜡块。搜集VSCC患者的临床病理资料：年龄32～75岁，平均年龄（55.9±3.6）岁。根据1988 FIGO临床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例；分化程度：高分化19例，中分化10例，低分化6例；淋巴结转移10例，无淋巴结转移25例。

1.1.2 实验试剂：小鼠抗人Cofilin-1单克隆抗体购自美国Proteintech公司，兔抗人单克隆Profilin-1抗体购自美国Abcam公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruze公司。SP试剂盒、DAB显色试剂盒和辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP）购自北京中山金桥公司，ECL试剂盒和BCA试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化方法检测CFL1及PFN1蛋白的表达：石蜡切片常规脱蜡水化。3%H2O2常温下孵育20 min，使内源性过氧化物酶灭活，后行抗原修复，常温下羊血清孵育30 min，Cofilin-1（1∶100）及Profilin-1（1∶400）于4℃冰箱过夜，生物素标记山羊抗兔IgG室温孵育15 min，室温下S-A/HRP中孵育15 min，后DAB显色剂显色，最后苏木素复染封片。以PBS代替一抗作为阴性对照片。结果判定：CFL1及PFN1均为细胞质和细胞核/细胞质着色，阳性染色为黄色或棕黄色颗粒。使用生物图片处理系统Meta Morph进行平均光密度值测算。每张切片平均光密度值的测算，选择高倍镜下5个不同视觉区域，每个区域包括正常皮肤的表皮和部分真皮、癌组织的癌巢与间质，然后计算同一张切片的平均光密度值。

1.2.2 免疫印迹方法：取VSCC组织（10例）和正常外阴皮肤组织（10例），裂解液提取组织总蛋白，制好电泳凝胶后行SDS-PAGE电泳，蛋白电泳转至聚偏二氟乙烯膜，其用5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，加入一抗［CFL1（1∶100）；PFN1（1∶400）；β-actin（1∶1 000）］4℃过夜，次日加二抗［山羊抗兔（1∶5 000）；山羊抗小鼠（1∶5 000）］，常温孵育2 h，ECL试剂盒显影。用β-actin作为内参照物。用Quantity One软件半定量分析特异性条带的灰度值，与内参照的灰度值的比较值作为蛋白的相对含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 CFL1在VSCC和外阴正常皮肤组织中的表达

CFL1阳性细胞表达于外阴正常表皮细胞全层，散在分布，呈细胞质和细胞核阳性（图1A），阳性细胞的平均光密度值0.284 9±0.011 6；VSCC癌巢细胞中有阳性表达，其间质中也有表达（图1B），阳性细胞的平均光密度值是0.341 0±0.012 0，2者有统计学差异（P=0.041）。

2.2 Profilin-1在VSCC和外阴正常皮肤组织中的表达

Profilin-1阳性细胞表达于外阴正常表皮近基底层和基底层，呈细胞质和细胞核阳性（图2A），阳性细胞的平均光密度值0.150 6±0.008 9，VSCC癌巢细胞中有阳性表达，其间质中也有表达（图2B），阳性细胞的平均光密度值是0.259 1±0.020 3，2者有统计学差异（P=0.028）。

2.3 CFL1与PFN1表达的相关性分析

相关性分析结果表明：CFL1及PFN1在VSCC中的表达呈正相关（r2=0.753，P＜0.001），见图3。

2.4 Western blot法检测CFL1与PFN1的表达

正常外阴皮肤中CFL1的平均灰度值比值（0.33±0.09）低于VSCC（0.99±0.03），2者比较有统计学差异（P=0.000）。正常外阴皮肤中PFN1的平均灰度值比值（0.88±0.14）低于VSCC（1.39±0.16），2者比较有统计学差异（P=0.000），见图4。

2.5 CFL1及PFN1的表达与VSCC的临床病理特点的关系

2.5.1 CFL1蛋白表达的平均光密度值：VSCCⅢ期高于Ⅰ期与Ⅱ期，两者差异有统计学意义（P＜0.05）；中、低分化组高于高分化组，两者差异有统计学意义（P＜0.05）；有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，两者有统计学上的差异（P＜0.05）；年龄＜45岁与≥45岁患者比较无统计学差异（P＞0.05）。

2.5.2 PFN1蛋白表达的平均光密度值：VSCCⅢ期高于Ⅰ期与Ⅱ期（P＜0.05）；中、低分化组略高于高分化组，但两者无统计学差异（P＞0.05）；有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组（P＜0.05）；年龄＜45岁与≥45岁患者比较无统计学差异（P＞0.05），见表1。

3 讨论

肌动蛋白结合蛋白作为一种调控肌动蛋白组装和拆卸的蛋白质，在肌动蛋白聚合与解聚的动态平衡中起了至关重要作用，它们有保持细胞形态、介导细胞迁移等生物学功能，且同癌细胞的转移和浸润紧密相关［8］。近年研究表明肿瘤细胞侵袭、转移与肌动蛋白结合蛋白介导的细胞骨架重组密切相关。肌动蛋白细胞骨架的组装活跃是促进肿瘤细胞运动和迁移，诱发肿瘤发生侵袭及转移的重要因素。

CFLl是真核细胞内的肌动蛋白结合蛋白中的一种，可改变肌动蛋白微丝结构，是肌动蛋白细胞骨架重构的重要调节因子。它的基本功能是连接纤维状肌动蛋白微丝（F-actin），使F-actin解聚，同时中止单体球状肌动蛋白微丝（G-actin）的汇集，进而增进了肌动蛋白的转变，这种机制可能和细胞伪足形成有关。Ghosh等［3］通过实验证明激活CFLl能诱导癌细胞的片状伪足生成，且能引导细胞移动的趋势，最终促进恶性细胞的迁移和侵袭。Yamaguchi等［9，10］通过实验用siRNA沉默CFL1基因表达后，肿瘤细胞中CFLl表达下调，进而抑制肿瘤细胞伪足的装配和稳定性，最终阻止细胞运动和肿瘤的侵袭。Yap等［11］研究表明在人脑胶质瘤的研究中CFLl水平和运动速率之间存在正相关，适量增加CFLl表达可以增加细胞的移行速度，而抑制CFLl的表达可降低癌细胞的迁移速率及侵袭性。同时，发现CFNl的过表达以浓度依赖的方式促进胶质母细胞瘤肿瘤细胞的运动，导致了肿瘤的侵袭，这些都提示CFNl的表达与肿瘤细胞侵袭、转移有关。关于CFLl的活性调节，Polachini等发现CFLl活性主要受磷酸化/去磷酸化因素的调节，由于CFNl N末端丝氨酸-3（serine-3，Ser-3）位点的磷酸化，导致CFLl灭活，进而抑制其F-actin的解聚功能，当这一位点再次去磷酸化后又可使CFLl对F-actin的解聚活性复活，此两种形式的交替协调控制肌动蛋白的聚合和解聚，从而影响细胞的迁移，细胞收缩等［12，13］。目前这种现象在口腔癌及卵巢癌中均已发现，Polachini等［13］研究证实CFLl的表达下调抑制口腔癌细胞侵袭。Zhou等［14］研究证实CFLl的表达上调可促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，导致卵巢癌的发展。在VSCC中，我们的研究发现CFNl高表达，且随着细胞分化程度降低、临床分期增高及有淋巴结转移CFLl表达增加，进一步提示CFLl在VSCC中促进了肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移，与VSCC的恶性进展呈正相关。

PFN1作为细胞微丝蛋白调节因子，在保持单体微丝蛋白和纤维状微丝之间动态平衡上发挥关键作用，它通过结合肌动蛋白，调整细胞骨架的重构，引发细胞运动。此外于细胞增殖和凋亡的过程中也起着重要的调节作用［15］。目前发现PFN1在一些肿瘤中低表达，如乳腺癌、胰腺癌。Zou等［16，17］研究表明PFN1可抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖，其机制为PFN1表达可上调PTEN基因，从而抑制AKT通路，继而引起p27蛋白增加，然后p27和cyclin E/ Cdk2复合体相连结使细胞周期停滞在G1期，最终抑制细胞增殖。Yao等［5］研究证实在胰腺癌细胞中，PFN1通过SIRT3-HIF1α机制促进细胞凋亡。因此认为PFN1可能是一个肿瘤抑制因子。但PFN1在另一些肿瘤中高表达，Zou等［16］在乳腺癌细胞系中研究发现PFN1的过表达可诱导MDA-MB-231的上皮间质转化，其机制是PFN1和肌动蛋白之间的相互作用诱导单体微丝蛋白和纤维状微丝之间失衡，进而影响肌动蛋白聚合；同时PFN1的过表达也增加了R-钙黏蛋白的表达，R-钙黏蛋白也可促进MDA -231细胞向上皮间质转化，增进肿瘤细胞的迁移、侵袭［7］。我们的研究显示PFN1在VSCC中高表达，且随着临床分期增高及有淋巴结转移，PFN1表达增加，而与细胞分化程度无关，进一步提示PFN1在VSCC中可能具有促进上皮间质转化作用，增加肿瘤细胞侵袭、转移的能力，而在细胞分化、增殖方面未起作用。

［1］Pfaendtner J，De L，Voth G.Actin filament remodeling by actin depolymerization factor/Cofilin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（16）：239-254.

［2］Nishimura S，Tsuda H，Kataoka F，et al.Overexpression of cofilin-1 can predict progression-free survival in patients with epithelial ovarian cancer receiving standard therapy［J］.Human Pathol，2011，42（4）：516-521.

［3］Ghosh M，Song X，Mouneimne G，et al.Cofilin promotes actin polymerization and defines the direction of cell motility［J］.Science，2004，304（5671）：743-746.

［4］Witke W.The role of profilin complexes in cell motility and other cellular processes［J］.Trends Cell Biol，2004，14（8）：461-469.

［5］Yao W，Ji S，Qin Y，et al.Profilin-1 suppresses tumorigenicity in pancreatic cancer through regulation of the SIRT3-HIF1α axis［J］. Mol Cancer，2014，13：187-199.

［6］Zoidakis J，Makridakis M，Zerefos P，et al.Profilin 1 is a potential biomarker for bladder cancer aggressiveness［J］.Mol Cell Proteomics，2012，11（4）：M111.009449.

［7］Minamida S，Iwamura M，Kodera Y，et al.Profilin 1 overexpression in renal cell carcinoma［J］.Int J Urol，2011，18（1）：63-71.

［8］曲东明，韩梅，温进坤.肌动蛋白结合蛋白［J］.细胞生物学杂志，2007，29（2）：219-224.

［9］Hotulainen P，Paunola E，Vartiainen M，et al.Actin-depolymerizing factor and cofilin-1 play overlapping roles in promoting rapid F-actin depolymerization in mammalian nonmuscle cells［J］.Mol Biol Cell，2005，16（2）：649-664.

［10］Yamaguchi H，Lorenz M，Kempiak S，et al.Molecular mechanisms of invadopodium formation：the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin［J］.J Cell Biol，2005，168（3）：441-452.

［11］Yap C，Simpson T，Pratt T，et al.The motility of glioblastoma tumour cells is modulated by intracellular cofilin expression in a concentration-dependent manner［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2005，60（3）：153-165.

［12］Vitolo M，Boggs A，Whipple R，et al.Loss of PTEN induces microtentacles through PI3K-independent activation of cofilin［J］.Oncogene，2013，32（17）：2200-2210.

［13］Polachini G，Sobral L，Mercante A，et al.Proteomic approaches identify members of cofilin pathway involved in oral tumorigenesis［J］.PLoS One，2012，7（12）：e50517.

［14］Zhou J，Wang Y，Fei J，et al.Expression of cofilin 1 is positively correlated with the differentiation of human epithelial ovarian cancer［J］.Oncol Lett，2012，4（6）：1187-1190.

［15］Stevenson R，Veltman D，Machesky L，et al.Actin-bundling proteins in cancer progression at a glance［J］.J Cell Sci，2012，125（5）：1073-1079.

［16］Zou L，Ding Z，Roy P.Profilin-1 overexpression inhibits proliferation of MDA-MB-231 breast cancer cells partly through p27kip1 upregulation［J］.J Cell Physiol，2010，223（3）：623-629.

［17］Das T，Bae Y，Wells A，et al.Profilin-1 overexpression upregulates PTEN and suppresses AKT activation in breast cancer cells［J］.J Cell Physiol，2009，218（2）：436-443.

（编辑 武玉欣）

Cofilin-1 and Profilin-1 Expression in Vulvar Squamous Cell Carcinoma and Its Clinical Significance

CUI Shou-bin1，2，JIANG Ying1，WU Xin1
（1.Department of Gynecology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，The Yantai Affiliated Hospital，Binzhou Medical College，Yantai264100，China）

ObjectiveTo investigate the expression of cofilin-1 and profilin-1 in vulvar squamous cell carcinoma（VSCC）and its significance.MethodsImmunohistochemic staining and Western blot were conducted to study the expression of cofilin-1 and profilin-1 in VSCC and its relationship with the clinicopathologic data.ResultsCofilin-1 expression was obviously higher in VSCC than in normal vulvar skins（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was significantly higher in the FIGO Ⅲ stage than in the FIGO Ⅰ and Ⅱ stages（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was obviously higher in those poorly and moderately differentiated VSCC than in those highly differentiated ones（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was obviously higher in patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P＜0.05）.Profilin-1 expression was obviously higher in VSCC than in normal vulvar skins（P＜0.05）.Profilin-1 expression was significantly higher in the FIGO Ⅲ stage than in the FIGO Ⅰ and Ⅱ stages（P＜0.05）.Profilin-1 expression was obviously higher in patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P＜0.05）.Profilin-1 expression had no statistically significant differences between the poorly and moderately differentiated VSCC and the highly differentiated ones（P＞0.05）.The Pearson correlation analysis showed that cofilin-1 and profilin-1 expression was positively correlated in vulva squamous cell carcinoma（r2=0.753，P＜0.001）.ConclusionCofilin-1 and profilin-1 expression associates with the emergence and development of VSCC.

cofilin-1；profilin-1；vulvar squamous cell carcinoma；immunohistochemistry；Western blot

R737.35

A

0258-4646（2015）01-0010-05

国家自然科学基金（30973190）；沈阳市科学技术计划项目（F11-264-1-39）

崔守斌（1982-），男，医师，硕士.

武昕，E-mail：xinwu.1964@aliyun.com

2014-10-04

网络出版时间：