白宇，赖亚新，李静，单忠艳

（1.中国医科大学附属第一医院内分泌科，内分泌研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室，沈阳110001；2.中国医科大学附属盛京医院内分泌科，沈阳110004）

PTU诱导大鼠低甲状腺素血症与胰岛素抵抗相关

白宇1，2，赖亚新1，李静1，单忠艳1

（1.中国医科大学附属第一医院内分泌科，内分泌研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室，沈阳110001；2.中国医科大学附属盛京医院内分泌科，沈阳110004）

目的 探讨低甲状腺素血症大鼠是否存在胰岛素抵抗（IR）及其可能机制。方法将12只SD大鼠随机分为正常对照（NC）组及低甲状腺素血症（HypoT4）组。NC组正常喂养，HypoT4组给予丙硫氧嘧啶（PTU）水（浓度为3 ppm）喂养。喂养8周后，眶后采血测定促甲状腺素（TSH）、总甲状腺素（TT4），用高胰岛素—正葡萄糖钳夹技术评估2组大鼠的胰岛素敏感性。应用ELISA方法检测大鼠血清胰岛素水平，通过Real-time PCR检测脂肪细胞的瘦素（Ob）和脂联素（APN）mRNA的表达水平。结果HypoT4组大鼠的血清TSH水平与NC组相比无统计学差异（P＞0.05），但TT4明显低于NC组（P＜0.05），2组大鼠的基础状态血糖和稳态血糖无统计学差异（P＞0.05）；HypoT4组的基础胰岛素水平有下降趋势，但较NC组无统计学差异（P＞0.05），钳夹稳态状态下胰岛素水平明显高于NC组（P＜0.05）；HypoT4组的葡萄糖清除率和葡萄糖代谢率明显低于NC组（P＜0.05），HypoT4组Ob mRNA表达水平低于NC组（P＜0.05），APN mRNA表达水平低于NC组，虽差异无统计学意义，但有明显下降趋势（P= 0.07）。结论低甲状腺素血症大鼠存在胰岛素抵抗，并可能与脂肪细胞分泌Ob及APN减少有关。

低甲状腺素血症；胰岛素抵抗；丙硫氧嘧啶；瘦素；脂联素

糖尿病和甲状腺功能减退是常见的内分泌系统疾病，均严重威胁人类的健康，更是心血管疾病的独立危险因素。糖尿病与甲状腺功能的相互作用也一直受到广泛关注。甲状腺激素调节基础能量代谢并通过多种途径影响糖脂代谢，临床及亚临床甲减患者常伴发糖尿病，而胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病发生的基础，已有研究证实甲状腺功能减退与胰岛素敏感性有关。然而对低甲状腺素血症与IR的关系的研究很少。本研究在建立低甲状腺素血症大鼠模型的基础上，探讨低甲状腺素血症状态下是否存在IR，并通过检测脂肪组织分泌的与胰岛素敏感性关系密切的瘦素（leptin，Ob）和脂联素（adiponectin，APN）mRNA的表达水平变化，初步探讨低甲状腺素血症引起IR的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

8周龄SPF级SD大鼠12只，雌雄各半，体质量200～257 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。将大鼠饲养于中国医科大学实验动物部，饲养期间可自由饮水进食。适应性喂养1周后，将其随机分为正常对照组（NC组，n=6）和低甲状腺素血症组（HypoT4组，n=6）。HypoT4组给予丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）水（浓度为3 ppm）喂养，其他条件与NC组相同。于第8周采血检测甲状腺功能并进行高胰岛素—正葡萄糖钳夹实验。

1.2 高胰岛素—正葡萄糖钳夹实验

具体方法参考文献［1］。给予大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，分离左颈动脉和右颈内静脉，分别插入PE-50导管，用大头针封闭，并经颈部皮下隧道延续至颈背，缝合皮肤。颈静脉用于注入胰岛素和葡萄糖，颈动脉用于采血标本。待大鼠度过应激期后，于清醒状态下进行钳夹试验，实验前将大鼠禁食12 h。连接输液泵、输液管道及三通管等输液装置。首先，经颈动脉采血0.5 mL（0 min），测基础血糖（basic blood glucose，BBG）。基础胰岛素（basic insulin，BIns）（丹麦诺和诺德公司Novolin R，浓度0.08 U/mL）和30%葡萄糖注射液分别用数字式微量注射泵（SK-500Ⅲ型）进行注射。胰岛素以0.36 U·kg-1·h-1的恒定速度输入，5 min后用罗氏快速血糖仪测量血糖。若此时血糖超过BBG± 0.5 mmol/L，则开始输入30%葡萄糖。葡萄糖输注率从4～6 mg·kg-1·min-1开始，以后每5 min测1次血糖，不断调整葡萄糖输入速率，使血糖保持在BBG±0.5 mmol/L范围内。60 min后，若连续3次测得血糖保持在上述范围内，可认为达到稳态。此时取动脉血0.5 mL测血糖为稳态血糖（homeostasis blood glucose，HBG），胰岛素为稳态胰岛素（homeostasis insulin，HIns）。继续上述过程，直到120 min结束，共采血24次。计算钳夹实验60～120 min的平均葡萄糖代谢率（glucose metabolic rate，GMR）及葡萄糖清除率（glucose disposal rate，GDR），用于比较胰岛素敏感性。

1.3 标本留取及指标检测

动物禁食12～14 h后取材，给予大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，颈动脉取血，血样立即进行低温离心（3 000 r/min）10 min，分离血清置于-20°C冻存。取大鼠双侧附睾周围脂肪组织立即置于液氮中进行速冻，并转移至-70°C冻存。

采用固相化学发光酶免疫法测定血清促甲状腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、总甲状腺素（total thyroxine，TT4）（Immulite 1000，美国DPC公司）。大鼠血清胰岛素水平测定均采用酶联免疫吸附实验（ELISA），试剂盒购自北京擎日生物科技有限公司。Real-time PCR检测Ob和APN水平，试剂盒购自美国Santa Cruz公司。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 NC组和HypoT4组大鼠甲状腺功能评估

HypoT4组大鼠的血清TSH水平与NC组相比无统计学差异（P＞0.05），但TT4水平明显低于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 HypoT4组大鼠和NC组IR的比较

HypoT4组与NC组大鼠的BIns和HIns无统计学差异（P＞0.05）；HypoT4组的BIns水平有下降趋势，但较NC组无统计学差异（P＞0.05），钳夹稳态状态下胰岛素水平明显高于NC组（P＜0.05）；GDR和GMR明显低于NC组（P＜0.05）。见表2。

2.3 HypoT4组大鼠和NC组Ob和APN mRNA水平的比较

HypoT4组的Ob mRNA表达水平低于NC组（P＜0.05），APN mRNA表达水平低于NC组，但差异无统计学意义（P=0.07）。见表3。

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是指由各种原因引起的长期心输出量减少、心脏收缩或舒张功能不全，是心血管疾病终末期的表现。随着人口老龄化及心衰患者预期寿命增加，CHF已成为影响居民健康的高负担疾病[1-3]。目前，对于CHF的治疗，临床上以防止和延缓心衰发展、降低患者死亡率为主要目的，而利尿剂是改善CHF患者症状的一线药物[4]。然而，国外多项研究[5-6]指出，长期或过量使用利尿剂可能导致低血钾、低血钠、利尿剂抵抗、利尿过度所致肾功能恶化和肾素血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活等，进而加重病情，甚至导致患者死亡。

表2 NC组和HypoT4组大鼠血糖、胰岛素、葡萄糖清除率、葡萄糖代谢率比较Tab.2 Values of BG，Ins，GDR and GMR in NC group and HypoT4group

BBG，basic blood glucose；HBG，homeostasis blood glucose；BIns，basic insulin；HIns，homeostasis insulin；GDR，glucose disposal rate；GMR，glucose metabolic rate.1）P＜0.05 vs NC group.

Group BBG（mmol·L-1）HBG（mmol·L-1）BIns（mU·L-1）HIns（mU·L-1）GDR（mg·kg-1·min-1）GMR（mg·kg-1·min-1）NC 6.62±0.79 6.72±0.90 0.36±0.09 3.77±0.87 40.38±15.18 37.76±18.33 HypoT47.15±0.98 7.11±0.86 0.25±0.12 5.71±1.181）19.17±8.081）13.97±6.171）

表3 NC组和HypoT4组大鼠Ob和APN mRNA水平比较（Tab.3 Levels of mRNA of Ob and APN in NC group and HypoT4group

1）P＜0.05 vs NC group.

Group Ob APN NC 0.31±0.05 5.12±2.13 HypoT40.15±0.081）2.65±1.85

3 讨论

PTU是治疗甲状腺功能亢进症的常用药物，其作用机理是抑制甲状腺内过氧化物酶活性，阻止甲状腺内酪氨酸碘化及碘化酪氨酸的缩合，从而抑制甲状腺素的合成。同时，PTU可在外周组织中抑制T4转变为T3，使得血清中活性较强的T3含量较快降低。动物实验中，给予大剂量PTU是常用的建立甲状腺功能减退模型的方法，本研究通过给予小剂量PTU［2］（浓度为3 ppm）建立了大鼠低甲状腺素血症的模型。在给予该浓度PTU 13个月后，大鼠的甲功仍为低甲状腺素状态（本研究组另一个实验的观察结果），说明低甲状腺素模型稳定。

目前，甲状腺功能状态对糖代谢的影响受到关注，且争论不一。Alvirde-Garcia等［3］在对西班牙人进行的关于亚临床甲减与代谢综合征及IR的横断面研究中发现，即使在正常范围内的低甲状腺素水平也易出现血糖、胰岛素及IR指数增高，且FT4与胰岛素、IR指数呈负相关。Owecki等［4］对22名有甲状腺切除或放碘治疗病史（不伴有糖尿病或者糖耐量异常）的甲减妇女的研究中，仅发现胰岛素与FT4呈负相关。然而Chen等［5］在我国福建省对5 080人的流行病学调查分析中，发现IR和β细胞功能与TSH呈负相关，与FT4无关。本研究组前期流行病学的调查结果显示正常范围的TSH水平与胰岛素抵抗指数（homeostasis model of assessment for insulin resistence index，HOMA-IR）无关［6］。本研究通过高胰岛素—正葡萄糖钳夹实验证实低甲状腺素血症组大鼠在钳夹稳态状态下胰岛素水平明显高于正常对照组（P＜0.05），且GDR及GMR明显低于正常对照组（P＜0.05）。表明外周组织对葡萄糖的敏感性降低，低甲状腺素状态下已存在IR。该结果与西班牙学者Prats-Puig等［7］的研究结果相同，血清FT4与胰岛素抵抗独立相关。关于低甲状腺素血症引起IR的可能机制为：（1）T4调节脂肪组织分泌与IR相关的脂肪因子，从而影响外周组织对胰岛素的利用；（2）在肌肉组织T4通过Ⅱ型脱碘酶转化为T3，而Ⅱ型脱碘酶的活性下降导致肌肉细胞内T3减少，使得葡萄糖感受器受损，进而导致胰腺β细胞功能紊乱，影响葡萄糖代谢［8，9］；（3）肌肉组织和脂肪细胞中的葡萄糖转运体4（glucose transporter 4，GLUT4）转录和易位发生障碍导致胰岛素刺激的葡萄糖转运下降［8］；（4）甲状腺功能轻度减退使基础代谢率降低导致肥胖［10］。

脂肪组织不仅是储存脂质的仓库，还通过分泌脂肪因子行使复杂的代谢及内分泌功能，Ob和APN是脂肪组织分泌的2个最重要的脂肪因子，调节糖代谢过程［11］。Ob能产生饱腹感，消耗能量。APN具有增强胰岛素敏感性、抗炎症过程、调节脂代谢等多种效应。Ob可减少GLUT4的含量，在外周可抑制脂肪酸聚集；APN可刺激脂肪酸氧化，抑制糖异生。它们的共同作用方式是通过激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶增加脂肪酸氧化，从而发挥代谢作用［12］，影响胰岛素敏感性。目前关于甲状腺功能与Ob和APN变化关系的研究较少且观点不同，并大多集中在甲减及甲亢状态下的血液中Ob和APN的变化。本研究发现给予8周PTU后，低甲状腺素血症组大鼠Ob mRNA表达水平低于正常对照组，APN mRNA表达水平与正常对照组相比也有下降趋势，与Shahramian等［13］和Samira［14］的报道一致。提示在低甲状腺素血症状态下产生的IR可能与Ob和APN的减少有关。

综上所述，本研究成功建立了PTU诱导低甲状腺素血症大鼠模型，并进一步验证了低甲状腺素血症时存在IR，其发生可能与Ob和APN的表达水平降低有关。因此，筛查甲状腺素对及时发现IR的高危人群非常重要，并且也可据此对IR相关的疾病作出判断。

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（编辑 王又冬）

PTU-induced Hypothyroxinemia Is Correlated with Insulin Resistance in Rats

BAI Yu1，2，LAI Ya-xin1，LI Jing1，SHAN Zhong-yan1
（1.Department of Endocrinology and Metabolism，Institute of Endocrinology，Liaoning Provincial Key Laboratory of Endocrine Disease，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Endocrinology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate whether the insulin resistance（IR）exists in the rats with propylthiouracil（PTU）-induced hypothyroxinemia and explore its possible mechanism.MethodsA total of 12 SD rats were randomly divided into two groups：normal control group（NC）and hypothyroxinemia group（HypoT4）.The NC group was normally fed，and the HypoT4group was fed with PTU water（3 ppm）.Eight weeks later，the blood samples of both groups were collected to measure the TSH and TT4.The hyperinsulinemic-euglycemic clamp technique was used to assess the insulin sensitivity and the serum insulin level was determined by ELISA method.Real-time PCR technology was used to measure the expression level of Leptin mRNA and Adiponectin mRNA in adipocytes.ResultsThere was no significant difference in TSH level between two groups（P＞0.05），but TT4 of the HypoT4group was obviously lower than that of NC group（P＜0.05）.No statistical difference was found between two groups about the basic blood glucose（BBG）and the homeostasis blood glucose（HBG）（P＞0.05）.No statistical difference was observed between two groups on the basic insulin（BIns）（P＞0.05），but the insulin level was tending downwards in the HypoT4group.Under the clamp steady state，the insulin level of the HypoT4group was obviously higher than the NC group（P＜0.05）.The glucose disposal rate（GDR）and the glucose metabolic rate（GMR）of the HypoT4group were lower than that of the NC group（P＜0.05）.The Leptin mRNA expression level of the HypoT4group was lower than the NC group（P＜0.05）.The Adiponectin mRNA expression level was lower than the NC group with a clear declining trend，however，there is no statistical difference（P=0.07）.ConclusionInsulin resistance exists in the rats with hypothyroxinemia，which is possibly relevant to the reduced excretion of Leptin and Adiponectin in adipocytes.

hypothyroxinemia；insulin resistance；propylthiouracil；leptin；adiponectin

R581.9

A

0258-4646（2015）01-0027-04

国家自然科学基金（81300645）

白宇（1986-），女，医师，硕士.

单忠艳，E-mail：shanzhongyan@medmail.com.cn

：2014-09-18

网络出版时间：