何璇，韦维，陈文霞

（广西医科大学附属口腔医院牙体牙髓病科，广西 南宁 530021 E－mail：hexuan269＠163.com）

组织工程化牙髓再生包括三个基本要素：种子细胞、生物支架和局部诱导微环境［1］。含有未分化间充质干细胞的牙髓细胞来源相对广泛、分离培养过程简单，使其进入牙髓再生种子细胞的选择之列。富血小板纤维蛋白（platelet－rich fibrin，PRF）因其具有良好的三维结构和生长因子释放性能，目前已有研究者将其作为支架材料应用于组织再生领域［2－3］。

本研究通过探索PRF 凝胶析出液对人牙髓细胞（human dental pulp cells，hDPCs）体外矿化的影响，评价PRF凝胶作为牙髓组织再生支架的生物学活性。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 DMEM 培养基（Hyclone，美国）；胎牛血清（Hyclone，美国）；胰蛋白酶（索莱宝，北京）；地塞米松（Sigma，美国）；β－甘油磷酸钠（Sigma，美国）；维生素C（Sigma，美国）；5ml一次性使用真空采血管（精字，南昌）；PBS（迈新，福州）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；CO2孵育箱（Sheldon Manufacturing公司，美国）；倒置显微镜及照相系统（Olympus公司，日本）；台式离心机（Sigma，美国）。

1.2 hDPCs的分离培养 经广西医科大学附属口腔医院伦理委员会通过，经患者知情同意。选取患者因治疗需要拔除的健康恒牙，无菌高速涡轮机金刚砂车针沿牙釉质－牙骨质界进行环形切割，暴露髓腔，取出牙髓后转移至超净台。剪弃根尖1 mm 牙髓，在培养皿中将牙髓组织剪碎成约1mm×1mm×1mm 大小的组织块若干。用滴管将组织块转移至25ml塑料培养瓶中，均匀平铺于培养瓶底部，组织块间距5～10 mm。加入1.5ml含20%FBS的DMEM 培养基。置饱和湿度、含5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。每2～3d换液1次。待细胞生长达80%～90%融合时，胰蛋白酶消化传代。

1.3 PRF凝胶析出液的制备 经广西医科大学附属口腔医院伦理委员会通过，获得志愿者的知情同意。抽取志愿者静脉血5ml即刻置入真空采血管（不含任何抗凝剂），采用Choukroun一步离心法［4］，即400g离心10min，静置5min制备PRF 凝胶，离心后血液分为3 层，上层为液态贫血小板血浆（platelet－poor plasma，PPP），下层为红细胞，中间层即为PRF 凝胶。将真空采血管中的PRF 凝胶取出并称重，每1.0g PRF凝胶置入2.5ml的DMEM 中，于第7d取析出液。

1.4 PRF 凝胶析出液对hDPCs体外矿化的影响 取第3代hDPCs，以1×104／孔的密度接种于6孔板，在常规培养基（含10%FBS、100U／ml青霉素和100 μg／ml链霉素的DMEM 培养基）中添加PRF 凝胶析出液孵育3d（析出液与培养基的比例为1∶1），以常规培养基作对照。在细胞贴壁生长达到80%融合时，更换含10 mmol／Lβ－甘油磷酸钠、100μg／ml维生素C、10nmol／L地塞米松、20%FBS的DMEM 矿化诱导液，每3d换液1次。

1.5 茜素红染色 矿化诱导21d时，从培养箱中取出6孔板，PBS浸泡清洗3次，40g／L 多聚甲醛固定15min，PBS冲洗3次，加入0.2% 茜素红溶液，37 ℃染色30min，蒸馏水洗去多余染料，晾干，镜检。

1.6 RT－PCR 反应 矿化诱导21d时，从培养箱中取出6孔板，用Trizol法提取总RNA 并逆转录合成cDNA；以甘油醛－3－磷酸脱氢酶（glyceraldehyde－3－phosphate，GAPDH）做内参，按试剂盒说明书进行实时定量PCR 反应，检测ALP mRNA 表达水平，所用各引物序列见表1，实验重复3次。

表1 人ALP引物序列

2 结果

2.1 组织块培养法培养hDPCs 原代细胞培养时，贴壁的组织块在体外培养5～7d开始向外爬出细胞，细胞呈典型的长梭形、成纤维细胞样形态，15d时可传代。传代后细胞呈放射状集落生长，形态稳定，平均约4d传代1次，见图1。

图1 组织块法培养牙髓细胞

2.2 茜素红染色结果 矿化诱导21d后，茜素红染色观察到hDPCs由长梭形、成纤维细胞样形态变成了鹅卵石状并呈叠瓦状排列，实验组有少量橘红色的钙结节生成，而对照组无钙结节生成，见图2。

图2 hDPCs矿化诱导茜素红染色结果

2.3 RT－PCR 结果 诱导矿化21d后，RT－PCR检测ALP mRNA 表达水平显示，经PRF析出液孵育后的hDPCs的ALP表达水平是对照组的1.5倍，差异具有统计学意义（P ＜0.05），见图3。

图3 PRF凝胶析出液对hDPCs的ALP mRNA 表达水平的影响

3 讨论

牙髓细胞的成分包括成牙本质细胞、成纤维细胞、防御细胞和储备细胞。成纤维细胞是牙髓的主体细胞，又称为牙髓细胞。成纤维细胞可产生明胶状基质和胶原纤维，未成熟的成纤维细胞可分化为成牙本质细胞［5］。本研究采用组织块培养法原代培养牙髓细胞，所得到的细胞以长梭形的成纤维细胞为主。牙髓干细胞可从牙髓细胞中筛选分离获得，然而干细胞移植需要复杂的分离过程及昂贵的细胞处理费用，并存在一定的致瘤风险。因而本研究采用来源相对广泛、分离培养过程简单的牙髓细胞作为种子细胞。

PRF被誉为第二代血小板浓缩物［6］，其特有的三维结构可以为组织再生提供支架，并且在降解的过程中可缓慢释放多种生长因子促进组织修复和再生［7］。本研究通过茜素红染色和RT－PCR 评估PRF 凝胶析出液对hDPCs体外矿化的影响。茜素红染色结果表明，矿化诱导21d后，经PRF凝胶析出液孵育后的hDPCs可观察到钙结节生成，而未经PRF 凝胶析出液孵育的hDPCs无钙结节生成。ALP是参与骨等矿化组织形成、代谢和再生的一种功能性标志酶［8］。牙乳头外胚间充质细胞向成牙本质细胞分化的过程中可分泌矿化前基质，后者在ALP等矿化因子作用下才最终形成牙本质。较高的ALP 是牙髓细胞分化的前提条件，其活性的增高是hDPCs早期成牙本质／成骨向分化的标志［9］。本研究RT－PCR 结果显示，经PRF析出液孵育后hDPCs的ALP mRNA 表达水平是对照组的1.5倍。

综上所述，PRF凝胶析出液可促进人牙髓细胞矿化，提示其具有成为牙髓再生的支架材料所必需的生物学活性。

［1］ Yildirim S，Fu SY，Kim K，et al.Tooth regeneration：a revolution in stomatology and evolution in regenerative medicine［J］.Int J Oral Sci，2011，3（3）：107－116.

［2］ Ji B，Sheng L，Chen G，et al.The Combination use of platelet－rich fibrin and treated dentin matrix for footh root regeneration by cell homing［J］.Tissue Engineering Part A，2015，21（1－2）：26－34.

［3］ Chen Y，Niu Z，Xue Y，et al.Improvement in the repair of defects in maxillofacial soft tissue in irradiated minipigs by a mixture of adipose－derived stem cells and plateletrich fibrin［J］.Br J Oral Maxillofac Surg，2014，52（8）：740－745.

［4］ Choukroun J，Adda F，Schoeffler C，et al.Une opportunitéen paro－implantologie：le PRF［J］.Implantodontie，2001，42（55）：e62.

［5］ Couble M－L，Farges J－C，Bleicher F，et al.Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures［J］.Calcif Tissue Int，2000，66（2）：129－138.

［6］ Dohan DM，Choukroun J，Diss A，et al.Platelet－rich fibrin（PRF）：a second－generation platelet concentrate.Part I：technological concepts and evolution［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e37－44.

［7］ Dohan Ehrenfest DM，De Peppo GM，Doglioli P，et al.Slow release of growth factors and thrombospondin－1in Choukroun＇s platelet－rich fibrin（PRF）：agold standard to achieve for all surgical platelet concentrates technologies［J］.Growth Factors，2009，27（1）：63－69.

［8］ Sumita Y，Honda MJ，Ohara T，et al.Performance of collagen sponge as a 3－D scaffold for tooth－tissue engineering［J］.Biomaterials，2006，27（17）：3238－3248.

［9］ Bakopoulou A，Leyhausen G，Volk J，et al.Comparative analysis of in vitro osteo／odontogenic differentiation potential of human dental pulp stem cells （DPSCs）and stem cells from the apical papilla（SCAP）［J］.Archives of oral biology，2011，56（7）：709－721.