杨小青 宋金春 谢顺岚 郝好华

1.武汉大学人民医院药学部袁湖北武汉430060曰2.武汉大学药学院袁湖北武汉430072

不同提取方法莲子心总生物碱抗氧化活性比较

杨小青1宋金春1谢顺岚2郝好华1

1.武汉大学人民医院药学部袁湖北武汉430060曰2.武汉大学药学院袁湖北武汉430072

目的比较不同提取方法莲子心总生物碱的抗氧化活性袁并以此为指标评价提取工艺。方法采用回流提取尧超声提取尧浸渍提取法提取莲子心中总生物碱袁并比较3种提取物的体外抗氧化活性。结果总生物碱提取率院回流提取[(1.03依0.01)%]跃超声提取[(0.92依0.01)%]跃浸渍提取法[(0.89依0.02)%]曰主要成分总生物碱含量院超声提取法跃回流提取法跃浸渍提取法袁1袁1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)尧2袁2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)尧羟基(窑OH)自由基清除活性院回流提取跃超声提取跃浸渍提取法袁超氧阴离子活性院超声提取法跃回流提取法跃浸渍提取法。结论回流提取法具有最高的提取率袁以及强抗氧化活性袁为最佳提取方法。

莲子心；总生物碱；提取方法；抗氧化

莲子心是睡莲科莲(Nelumbo nucifera Gaertn)的成熟种仁。根据国内外文献报道可知袁其在我国已具有两千多年的栽种历史袁尤其在湖南尧湖北尧江苏尧福建尧浙江等地被广泛种植[1]。在日常生活中袁莲子心可作为茶饮料袁具有清心火尧止遗精之功效[2]袁同时也被用作观赏植物。自1962年研究者首次从莲中分离出生物碱袁由于其广泛的药理活性[3-5]袁如抗HIV尧抗高血脂尧抗血小板聚集尧降血压尧抗氧化尧抗菌尧抗肥胖尧抗糖尿病以及抑制黑色素生成活性袁莲子心生物碱受到众多研究者青睐。随着现代生活节奏的不断加快袁环境污染尧放射线辐射等外界因素导致人体内产生大量自由基。研究证实袁机体衰老尧癌症等重大疾病的产生都与体内产生的过量自由基相关[6]。而目前市场上多采用化学合成的抗氧化剂对人体具有较强的毒副作用[7]袁因此袁着手寻找一种天然抗氧化剂不仅可以解决过氧化对机体产生的危害袁还能减少抗氧化剂自身对人体的毒副作用。本研究采用热回流尧超声以及冷浸3种不同提取方法得到莲子心总生物碱袁在比较提取率的基础上袁比较3种不同方法得到的提取物体外抗氧化活性的能力袁两者结合作为评价指标优选最佳提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 主要实验仪器

SK5200H型超声波清洗器(郑州长城科工贸有限公司)袁UV-1800型紫外可见分光光度计(日本岛津)袁RE52CS型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)袁精密恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)袁XW-80A型漩涡混合器(上海科导超声仪器有限公司)袁YXJ-1型高速离心机(深圳天南海北实业有限公司)。

1.2 主要化学试剂

丁羟甲苯(BHT袁含量为99.0%)袁硫代巴比妥酸(TBA)袁ABTS[2,2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基]袁DPPH(1袁1-二苯基-2-苦肼基自由基)袁福林酚试剂(Folin-Ciocalteu's reagent)袁购于Sigma公司曰过硫酸钾袁30%双氧水袁三氯甲烷袁铁氰化钾袁三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)袁氯化亚铁袁焦性没食子酸袁三氯乙酸(TCA)袁2-脱氧核糖袁抗坏血酸(VC袁含量为99.7%)袁乙二胺四乙酸二钠袁购于国药集团化学试剂有限公司曰没食子酸对照品袁购于中国药品生物制品检定所袁含量为89.9%。

1.3 植物材料

莲子心袁购于湖北天济中药饮片有限公司袁产地为湖北洪湖袁生产批号院20140101。

1.4 方法

1.4.1 莲子心中总生物碱的提取

莲子心磨成粗粉袁过400目筛袁真空干燥袁分别采用回流提取法尧超声提取法尧浸渍提取法进行提取。

1.4.1.1 回流提取法称取莲子心粗粉100 g袁置于1000 mL圆底烧瓶中加入70%乙醇(固液比1颐3)袁回流3次袁每次1 h袁趁热过滤合并滤液袁减压旋转蒸发回收乙醇袁浸膏溶液加1%盐酸调至pH 1~2袁过滤袁滤液用1%氨水调至pH 9~10袁用等体积氯仿萃取2次袁分液合并氯仿层袁用无水硫酸钠脱水袁过滤袁减压旋转蒸发回收氯仿得浸膏袁用1%盐酸溶解后转移到烧杯中袁再用1%氨水调至pH 9~10析出沉淀袁加水至300mL左右静置袁用砂芯漏斗过滤得沉淀袁冷冻干燥得莲心总碱粉末。

1.4.1.2 超声提取法称取莲子心粗粉100 g袁置于1000 mL烧杯中加入70%乙醇(固液比1颐3)袁封口超声提取3次袁每次45min袁过滤之后合并滤液袁余下步骤及条件均同回流提取法。

1.4.1.3 浸渍提取法称取莲子心粗粉100 g袁置于1000 mL烧杯中加入70%乙醇(固液比1颐3)袁封口浸渍3次袁每次8 h袁过滤合并滤液袁余下步骤同上。

1.4.2 莲子心不同提取方法所得提取液中总生物碱含量测定

精密称取莲心碱高氯酸盐对照品5 mg袁无水乙醇溶解袁冷却至室温袁并定容至25 mL袁振荡摇匀袁得浓度为200滋g/mL的莲心碱高氯酸盐对照品标准溶液。精密吸取上述标准溶液1.0尧1.5尧2.0尧2.5尧3.0尧3.5尧4.0 mL袁分别置于7支10 mL容量瓶中袁用无水乙醇稀释至刻度袁振荡摇匀。静置10min后于282 nm处测量吸光度袁用无水乙醇作为空白对照袁以莲心碱高氯酸盐对照品的浓度为横坐标袁吸光度为纵坐标袁计算线性回归方程。

准确称取野1.4.1冶中干燥粉末各10mg袁置于250mL容量瓶中袁无水乙醇溶解袁并定容到刻度线袁按上述实验步骤测定吸光度袁每种提取液平行测三组袁根据莲心碱高氯酸盐对照品标准溶液浓度与吸光度标准曲线回归方程计算各提取液中总生物碱含量(%)。

1.4.3 莲子心不同提取方法所得提取液中总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu比色法[8]测定莲子心提取物中总酚的含量。精密称取没食子酸11.12mg袁加水溶解并定容至25 mL袁得浓度为0.4 mg/m L的对照品标准溶液。精密吸取对照品标准溶液50尧100尧200尧300尧400尧500尧600滋L于25mL容量瓶中袁加蒸馏水6mL袁福林酚试剂0.5 mL袁在0.5~8 min内加入1.5 mL 20% Na2CO3袁充分混匀后袁加水定容至刻度袁在30益下避光反应30min袁以6.0mL蒸馏水代替对照品标准液为空白对照袁于波长760 nm测定吸光度袁绘制标准曲线。

样品总酚含量测定院精密称取野1.4.1冶中各干燥粉末20mg配制成400滋g/mL溶液袁吸取200滋L样品于25 m L棕色瓶中袁按上述方法测定吸光值袁代入公式得没食子酸当量。

1.4.4 体外抗氧化活性检测

1.4.4.1 DPPH自由基清除测试一定浓度范围的莲子心乙醇提取物0.3 mL分别加入2.7 m L的0.2 mmol/L DPPH(用无水乙醇溶解)袁涡旋混匀后袁将配好的样品避光静置1 h后在517 nm处测其吸光度。同样的方法以1mL无水乙醇代替提取物作为空白对照袁同样浓度范围的BHT尧VC作为阳性对照[8]。

其中袁A玉表示空白对照DPPH的吸光度袁As表示待测样品DPPH吸光度。

1.4.4.2 ABTS自由基清除试验7 mmol/L ABTS与2.45 mmol/L的K2S2O8以9颐1(V/V)比例混合袁室温下静置16 h袁使用前稀释8倍作为ABTS储备液。一系列浓度范围的莲子心乙醇提取物(1.0 mL)中分别加入2.5mL ABTS储备液袁混匀后避光反应20min并于734 nm波长处测定吸光值。以1 mL蒸馏水加ABTS待用混合液作为空白对照袁VC尧BHT作为阳性对照[9]。

ABTS清除率(%)=[(A玉-As)/A玉]伊100%

其中袁A玉表示空白对照ABTS的吸光度袁As表示待测样品ABTS吸光度。

1.4.4.3 羟基自由基清除反应体系中分别加入10mmol/L的2-脱氧核糖400滋L尧FeCl3窑6H2O(10mmol/L)100滋L尧EDTA-2Na(1mmol/L)100滋L尧H2O2(10mmol/L)100滋L尧样品(10~100滋g/mL)100滋L袁再加入VC(1 mmol/L) 200滋L引发反应袁在37益下反应1 h袁加入1 mL 0.5%TBA的NaOH(0.025 mol/L)溶液和1 mL 30% TCA水溶液袁混合物80益水浴加热30 min袁冷却。在532 nm处测定吸光度值(As)袁以0.05mol/L PBS(pH 7.4)在反应体系中代替样品作为空白对照测得吸光度值(A玉)袁平行测定三组袁计算吸光度平均值袁计算清除率袁同浓度范围的BHT作为阳性对照[10]。

羟基自由基清除率(%)=[(A玉-As)/A玉]伊100%

其中袁AI表示空白对照羟基自由基的吸光度袁AS表示待测样品羟基自由基的吸光度。

1.4.4.4 超氧阴离子自由基清除1 mL 200滋g/mL待测样品加入4.5 mL(pH 8.2袁0.05 mol/L)Tris-HCl缓冲液在25益下反应10min袁加入600滋L 0.003mol/L邻苯三酚(用10mmol/L盐酸溶解)袁充分反应后立即在325 nm处测定吸光度袁每隔30 s测定1次吸光度袁直至吸光值不再发生明显变化袁空白对照用10mmol/L盐酸代替样品袁BHT用作阳性对照。平行测定三组袁邻苯三酚的自氧化速率可以根据吸光度-时间曲线计算斜率袁得出斜率平均值[11]。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析袁正态分布计量资料以均数依标准差(x±s)表示袁多组间比较采用方差分析袁两两比较采用LSD-t检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同提取方法所得莲子心提取物提取率

回流提取尧超声提取尧浸渍提取3种方法所得莲子心乙醇提取物干燥粉末重量见表1。

表1 莲子心不同提取方法所得提取物的提取率(±s)

表1 莲子心不同提取方法所得提取物的提取率(±s)

注院与回流提取法比较袁*P<0.05

?

2.2 莲子心乙醇提取物中总生物碱含量

采用紫外分光光度法检测提取液中总生物碱含量袁根据总生物碱在282 nm处的特征吸收峰袁得到线性回归方程院y=0.0139x-0.0339袁R2=0.9999袁计算出不同提取方法中所得的总生物碱浓度见表2。

表2 莲子心不同提取方法所得提取液中总生物碱的含量(±s)

表2 莲子心不同提取方法所得提取液中总生物碱的含量(±s)

注院与超声提取法比较袁*P<0.05

?

2.3 莲子心乙醇提取物中总酚含量

没食子酸标准曲线回归方程为院y=0.099 047x+ 0.039 14袁R2=0.998袁计算三种提取方法中总酚含量袁结果见表3。

表3 莲子心不同提取方法所得提取液中总酚的含量(±s)

表3 莲子心不同提取方法所得提取液中总酚的含量(±s)

注院与回流提取法比较袁*P<0.05

?

2.4 体外抗氧化活性比较

2.4.1 DPPH自由基清除率比较

回流提取尧超声提取尧浸渍提取法所得莲子心乙醇提取物在2.70~48.65滋g/mL浓度范围内对DPPH自由基具有良好的清除作用袁且具有明显的浓度依赖性(图1)袁VC尧BHT以及3种提取物对DPPH自由基的半数清除率(IC50)见表4。

图1 VC、BHT及3种不同提取方法所得提取物对DPPH自由基的清除作用

2.4.2 ABTS自由基清除率比较

在1.43~25.70滋g/mL范围内袁3种不同提取方法所得莲子心乙醇提取物对ABTS自由基的清除作用袁与VC尧BHT比较结果见图2袁IC50值见表4。

2.4.3 羟基自由基清除率比较

3种不同提取方法所得莲子心乙醇提取物对羟

表4 莲子心不同提取方法所得提取物自由基清除IC50值

图2 VC、BHT及3种不同提取方法所得提取物对ABTS自由基的清除作用

基自由基的清除作用见图3。以BHT作为阳性对照袁通过对清除率分析以及曲线拟合得到IC50值见表4。

图3 BHT和3种不同方法所得提取物对羟基自由基的清除作用

2.4.4 超氧阴离子清除率比较

采用邻苯三酚自氧化体系比较3种不同方法得到的莲子心提取物对超氧阴离子自氧化的抑制作用比较见图4。BHT作为阳性对照袁4种药物作用于邻苯三酚体系其自氧化速率见表4。

3 讨论

莲子心乙醇提取物中总生物碱具有多种成分袁主要活性成分为莲心碱尧甲基莲心碱尧异莲心碱尧荷叶碱等[12]。袁小红[13]以总生物碱含量尧干浸膏得率为评价指标袁对水提法尧水提醇沉法尧半仿生提取法尧半仿生提取醇沉法四种方法进行比较袁提出以半仿生提取法为最佳。钟姣姣等[14]以莲子心为原料袁用微波辅助醇提水沉法提取总生物碱袁采用正交试验优选提取工艺袁在微波功率400W袁微波时间5min袁料液比1颐30(g颐mL),乙醇体积分数为65%的条件下可使莲子心总生物碱的提取率达到2.99%。

图4 BHT和3种不同方法所得提取物对超氧阴离子自由基的清除作用

本实验中3种提取方法所得莲子心乙醇提取物的干燥粉末院回流提取法跃超声提取法跃浸渍提取法。对其提取物的成分分析袁主要成分为总生物碱袁以及少量总酚袁总生物碱的含量院超声提取法跃回流提取法跃浸渍提取法曰总酚的含量院回流提取法跃超声提取法跃浸渍提取法。有文献报道袁莲子心总生物碱遇光和热不稳定袁可能是回流提取法中总生物碱的含量低于超声提取法的原因[15]。

抗坏血酸尧BHT是文献报道中常见的具有很好抗氧化活性的物质[16]袁在本研究中作为阳性对照。DPPH自由基的醇溶液呈紫色袁在517 nm处有吸收袁DPPH在反应体系中提供单电子袁一旦抗氧化剂接受单电子袁其吸收逐渐消失袁且抗氧化性越强袁褪色程度越深[17]。从图1中可以看出袁3种提取方法得到的提取物都具有一定的DPPH自由基清除能力袁并且在一定浓度范围内袁具有浓度依赖性袁与阳性对照相比具有显著性差异袁三种提取方法之间的IC50值有细微差异袁其中回流提取得到的提取物DPPH自由基清除能力最强。在ABTS反应体系中袁ABTS被氧化成蓝绿色的ABTS水溶性自由基袁抗氧化剂与ABTS自由基反应后使溶液褪色袁特征吸光度降低袁吸光度越低袁表明样品的抗氧化能力越强[18]。从图2可以看出袁在ABTS测试中袁3种提取方法的提取物与VC和BHT清除ABTS自由基能力的差异显著袁但是3种提取方法之间差异无统计学意义(P>0.05)袁3种提取方法得到提取液的半数清除率相近。本研究采用Fe3+-EDTA-抗坏血酸-过氧化氢体系产生羟基自由基袁脱氧核糖受羟基自由基进攻后裂解袁在酸性尧加热的条件下与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物袁抗氧化剂的存在可阻止羟基自由基攻击脱氧核糖[19]。根据图3可看出袁3种提取方法对羟基自由基具有不同的清除效率袁并且其半数清除率均明显高于BHT袁且回流提取物具有最强的清除能力(以IC50值比较)。本研究采用经典的邻苯三酚自氧化法评价3种不同提取方法所得总生物碱对超氧阴离子自氧化的抑制作用[20]袁根据图4袁3种方法得到的提取物的自氧化速率与阳性对照BHT相近袁浸渍提取物跃回流提取物跃超声提取物袁说明对超氧阴离子自氧化的抑制作用院浸渍提取法约回流提取法约超声提取法。

综上所述袁本实验采用提取率尧体外抗氧化活性能力为指标综合评价3种方法中莲子心中的总生物碱袁其可避免单因素误差袁而且根据其功效作为评价指标可以提高莲子心乙醇提取物的利用率。回流提取法是最适合提取莲子心中有效成分的方法袁此方法不仅操作简单尧方法稳定袁而且所得提取物具有很强的DPPH尧ABTS尧羟基自由基尧超氧阴离子清除活性袁表现强的抗氧化活性。

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Com parison of antioxidant activity of the total alkaloids in lotus p lumule by different extraction m ethods

YANG Xiaoqing1SONG Jinchun1XIE Shunlan2HAOHaohua1
1.Department,Pharmacy,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China;2.Pharma鄄ceutical College ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430072,China

Ob jective To compare the antioxidant activity of the total alkaloids in lotus plumule and to choose the best extraction technology of lotus plumule using different extractionmethods.Methods Reflux extraction,ultrasonic extrac鄄tion,dipping extraction method were used to extract total alkaloids in lotus and the antioxidant activity were used as a significant index to compare.Results The extraction rate:reflux extraction[(1.03依0.01)%]>ultrasonic extraction [(0.92依0.01)%]>dipping extraction[(0.89依0.02)%],themain component of total alkaloid content:ultrasonic extraction >reflux extraction>dipping extraction method,DPPH,ABTS,窑OH radical scavenging activity:reflux extraction>ul鄄trasonic extraction>dipping extraction method,superoxide anion:ultrasonic extraction>reflux extraction>dipping extraction.Conclusion Reflux extraction has the highest extraction rate,aswell as strong antioxidant activity,which is proved to be the best extractionmethod.

Lotus plumule;Total alkaloids;Extractionmethods;Antioxidant activity

R285

A[文献标识码]1673-7210（2015）06（c）-0100-05

院2015-01-05本文编辑院苏畅)

杨小青(1990-)袁女袁武汉大学第一临床学院药剂学专业2013级在读硕士研究生曰研究方向院临床药学。

宋金春(1964-)袁男袁博士袁主任药师袁教授袁硕士研究生导师曰研究方向院临床药学。