孙刚全，敖光第

（1.重庆市北碚区畜牧兽医局天府兽医站，重庆 北碚 400700；2.重庆市北碚区畜牧兽医局，重庆 北碚 400700）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 参考菌株。大肠杆菌CQYB3CE001、金黄色葡萄球菌MRSA252、沙门氏菌YBCSA015，由西南大学丁红雷副教授惠赠。

1.1.2 主要试剂。麦康凯琼脂培养基和麦康凯液体培养基购自杭州微生物试剂有限公司，DNA Marker III购自天根生化科技有限公司，2×Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3 药敏试纸。32种药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司和杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集。在重庆市北碚区龙凤桥镇采集粪便标本共计15份，包括某猪场猪粪5份和某鸡场鸡粪10份，每份样品均保证来自一个单独的动物。采集样品时用灭菌筷子挑取鸡或猪的粪便0.5～1g置于5mL灭菌离心管中，迅速放入装有冰袋的泡沫箱中，2h内运回实验室进行样品处理。

1.2.2 细菌分离。将盛有粪便的每个离心管加入3 mL PBS液，振荡，使粪便充分混匀，然后将其划线于麦康凯平板上，37℃恒温箱内培养24h。随后在每个麦康凯平板上各挑取一个具有典型大肠杆菌菌落特征的菌落，再次在麦康凯平板上划线进行纯培养。挑取纯培养后的菌落，涂片，革兰氏染色，然后于光学显微镜下观察细菌形态。

1.2.3 分离菌株的PCR检测

1.2.3.1 引物设计与合成。根据文献报道的大肠杆菌特异性基因phoA，用引物设计软件Primer Premier 5.0设计特异性引物。上游引物phoA-F：5′-CGATTC TGGAAATGGCAAAAG-3′，下游引物 phoA-R：5′-CGT GATCAGCGGTGACTATGAC-3′。引物由 Life Technologies公司合成。

1.2.3.2 模板制备。挑取经纯培养且有典型大肠杆菌菌落特征的菌落接种于麦康凯液体培养基，37℃下220r/min培养8h。将新鲜培养的菌液2mL 10000r/min离心1min，弃上清；加入1mL ddH2O，重悬，迅速以10000 r/min离心1min，弃上清；加入50μL ddH2O，100℃处理10min。保存于-20℃备用。

1.2.3.3 PCR 反应体系。2×Taq Master Mix 12 μL，phoA-F（10μM）2μL，phoA-R（10μM）2μL，模板 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系 24μL。

1.2.3.4 PCR反应条件。94℃预变性5min；94℃变性20s，58℃退火 20s，72℃延伸 45s，共 30个循环；最后72℃延伸6min。反应结束后取5μL反应产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统仪上观察结果。以大肠杆菌CQYB3CE001为阳性对照，金黄色葡萄球菌MRSA252和沙门氏菌YBCSA015作为阴性对照。

1.2.4 药物敏感性试验。根据《抗微生物药物敏感性试验执行标准》进行判定。37℃培养18h后观察结果。

2 结果

2.1 菌株分离情况、菌落形态及染色特征 经纯培养的细菌在麦康凯平板上呈圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的鲜桃红色菌落。将此15株细菌进行革兰氏染色后镜检，发现15株临床分离菌均为散在排列的两端钝圆的革兰氏阴性杆菌。无论菌落形态还是菌株形态，均提示这些细菌可能为大肠杆菌。

2.2 分离菌株的PCR鉴定 PCR检测结果表明阳性对照和所有临床分离株均能扩增出720bp的预期条带，阴性对照没有扩增出任何片段（见图1）。因此，可判断所有15株细菌均为大肠杆菌。

图1 大肠杆菌PCR鉴定结果

2.3 药物敏感性试验 试验结果表明：15株大肠杆菌均对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、羧苄青霉素、头孢拉定、头孢唑啉、四环素、林可霉素、罗红霉素、甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲基异恶唑、万古霉素12种药物耐药，特别是对所有的青霉素类抗生素和磺胺类药物耐药。10株鸡源性大肠杆菌对头孢哌酮、卡那霉素、新霉素、恩诺沙星、乳酸环丙沙星、氟苯尼考完全耐药或中度敏感，大部分菌株对妥布霉素、红霉素、链霉素、呋喃唑酮、庆大霉素和氧氟沙星耐药；而5株猪源性大肠杆菌仅对诺氟沙星、丁胺卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素4种药物敏感。15株细菌的耐药率在43.75%～93.75%之间，14株细菌的耐药率超过50%，超过2/3的菌株对23种药物耐药。通过表1可见，32种抗菌药物的耐药菌株比例从13.3%到100%不等，所有菌株均对其中12种药物耐药，占到所测试药物的37.5%。

3 讨论

本试验首先建立了一种用于大规模分离并快速鉴定畜禽粪便中大肠杆菌的方法。phoA基因存在于所有大肠杆菌中，而且在不同菌株间的序列有高度保守性，因此根据该基因在不同菌株间保守的核苷酸序列设计引物进行PCR检测，可以鉴定出是否是大肠杆菌。另外，本试验通过高温水煮的方法获得了PCR扩增的DNA模板，省时省力，降低了实验成本，适合基层兽医站应用。用合成的特异性引物采用PCR法扩增大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌中的phoA基因，结果大肠杆菌扩增出720bp左右的条带，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌未扩增出相应条带，证明phoA为大肠杆菌特有的基因。

表1 分离菌株对不同抗菌药物的耐药比例

本实验中所有分离菌株对12种抗菌药物完全耐药，超过2/3的菌株对超过23种药物耐药。如此之高的耐药率大大超出了我们的预料，说明采样地区的养殖场内的大肠杆菌耐药率相当高。因此，在今后的工作中，基层兽医站应加强对本辖区内养殖场抗生素使用的监管，根据药敏试验结果指导养殖场制定合理的用药方案，正确有效地使用抗菌药物。

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