李贵芝，周 红，房彩霞，张力辉，王 绵，王瑞英

(河北医科大学第二医院内分泌科，河北石家庄050000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DC)的主要病理改变之一是心肌纤维化，最后导致心功能减退、最终发生心功能衰竭［1］。而引起心肌损伤的关键是氧化应激(oxidative stress)的增强［2］。eNOS在调节心肌细胞功能中发挥重要作用。eNOS可减缓心肌损伤后的心肌重塑，发挥心肌保护作用［3］。RhoA是Rho蛋白家族的重要成员之一，Rho激酶(Rho kinase，ROCK)是最早发现的RhoA下游效应器。研究表明RhoA/ROCK信号通路在多种糖尿病慢性并发症中起着重要作用［4］。RhoA过度表达可导致心肌肥厚、心血管重塑、心肌收缩功能下降及心力衰竭［5］。目前RhoA/ROCK通路在高血糖状态下对心肌氧化应激的影响尚未见报道。本实验建立2型糖尿病大鼠模型，采用ROCK抑制剂法舒地尔(fasudil)进行干预，观察心肌上RhoA/ROCK信号通路对氧化应激及eNOS表达的影响，探讨糖尿病心肌损伤可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级雌性SD大鼠42只，体质量180～200 g，河北医科大学实验动物中心提供［许可证号:SCXK(冀)2012-1-003，动物质量合格证编号:1010399］自由进食水，按清洁级大鼠要求饲养。

1.2 主要试剂

盐酸法舒地尔注射液(天津红日药业有限公司);链脲佐菌素(Sigma公司);125I胰岛素放射免疫分析药盒(潍坊三维生物工程有限公司);羟脯氨酸、SOD和MDA试剂盒(均南京建成生物有限公司);Folin酚试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);蛋白磷酸酶抑制剂复合物(北京博迈德科技发展有限公司);兔抗大鼠磷酸化MYPT1(Thr853)抗体(Cell Signaling公司);兔抗大鼠磷酸化MYPT1(Thr696)多克隆抗体和小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(Santa Cruz公司);兔抗大鼠MYPT1抗体和兔抗大鼠eNOS抗体(均Bioworld生物公司);山羊抗兔荧光二抗和山羊抗小鼠荧光二抗(Rockland公司);其他试剂为分析纯产品。

1.3 主要方法

1.3.1 动物模型的建立:研究建立2型糖尿病模型［6］，10周末根据参考文献［7］建立的高胰岛素正常血糖嵌夹技术测葡萄糖输注率(glucose infusion rate，GIR)反映大鼠胰岛素抵抗情况，取血测FINS、FBG、TC、TG和BW。后将大鼠分为 NC组、DM组和DF组(每天腹腔注射10 mg/kg，分两次注射)。第24周末，腹主静脉取血测定 FINS、FBG、TC、TG和HbA1c。并根据公式测胰岛素抵抗指数 HOMAIR=FBG*FINS/22.5。取出心脏，称取心脏质量(HW)，计算心脏与体质量的比值(HW/BW)。取左心室部分组织，用4%多聚甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，后一部分心肌组织经HE染色于显微镜下观察组织病理结构。另一部分心肌组织切片经Masson染色，观察胶原沉积情况。取左心室小片组织，置于4%戊二醛固定用于电镜观察心肌的超微结构部分。

1.3.2 心肌组织羟脯氨酸(HYP)含量、MDA含量和SOD活力的测定:均按试剂盒的步骤进行操作，羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量占胶原蛋白的13.4%，将心肌HYP水平换算为心肌胶原(myocardial tissue collagen content，MCC)含量(μg/mg 组织)。

1.3.3 心肌组织eNOS免疫组织化学染色:标本固定，脱水、石蜡包埋和制片，兔抗大鼠eNOS抗体为一抗，按试剂盒说明进行染色，DBA染色，复染苏木素，梯度乙醇脱水，脱水封片。阴性对照Ⅰ抗用PBS代替，余步骤同上。如果细胞质或细胞膜内有棕黄色粗或细颗粒弥漫分布者为阳性反应。

1.3.4 Western blot方法检测p-MYPT1表达:心肌组织匀浆，提取蛋白、电泳和转膜。分别加入一抗1∶1 000稀释。TBS洗去未结合的一抗，振荡洗膜3次，每次10 min，加入荧光二抗，封闭1 h。TBS终止染色，照相。结束后应用凝胶图像分析系统进行吸光度扫描。心肌组织中磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(phosphorylation myosin phosphatase targets subunit-1，MYPT1)是ROCK的主要底物之一，用p-MYPT1来反应ROCK的活性。MYPT1磷酸化水平以p-MYPT1与MYPT1的吸光度比值表示)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 BW、HW和HW/BW变化

第10周末，糖尿病大鼠体质量显著高于对照组(p＜0.05)(表1)。第24周末，糖尿病组大鼠体质量显著低于对照组(p＜0.05);对照组较法舒地尔干预组体质量显著升高(p＜0.05)。糖尿病组大鼠的HW及HW/BW较对照组大鼠显著增加(p＜0.01，p＜0.01);法舒地尔干预组大鼠较糖尿病组大鼠上述指标显著降低(p＜0.01，p＜0.01)(表2)。

2.2 血生化指标的变化

第10周末，糖尿病大鼠空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)显著高于同期对照组大鼠(p＜0.01，p＜0.05)，(表1)。第24周末，糖尿病组大鼠FINS、FBG、糖化血红蛋白(HbA1c)、TG和TC均显著高于同期对照组大鼠(p＜0.01)，与法舒地尔干预组相比无明显差异(表3)。3组大鼠的血压无明显差异分别为(16.4±0.4)kPa，(16.5±0.4)kPa及(16.1±0.5)kPa。

2.3 血糖钳夹实验和HOMA-IR

在第10周末，糖尿病组大鼠的GIR显著低于对照组大鼠(p＜0.01)(表1)。第24周末，糖尿病组和法舒地尔干预组大鼠的HOMA-IR显著高于对照组(p＜0.01);糖尿病组和法舒地尔干预组大鼠的HOMA-IR无明显差异(表3)。

表1 10周各组大鼠生化、GIR和体质量Table 1 Changes of biochemical index，GIR and BW at week 10(x±s，n=6)

表2 24周各组体质量、心脏质量和心脏质量/体质量比值及SOD活力、MDA含量和MCC结果Table 2 BW，HW，HW/BW，SOD，MDA and MCC in each group at week 24(x ± s，n=8)

2.4 心肌形态学变化

2.4.1 HE染色结果:第24周末，对照组大鼠心肌纤维间排列整齐，结构清楚。间质可见少量成纤维细胞;糖尿病大鼠心肌纤维间排列紊乱，结构不清晰，间质中成纤维细胞增多;法舒地尔干预组大鼠较糖尿病组上述异常改变明显减轻。

2.4.2 心肌超微结构的改变:对照组大鼠心肌间质及肌原纤维结构清晰，排列整齐，间质胶原含量较少，线粒体形态正常;糖尿病组大鼠心肌间质及肌原纤维增粗，结构紊乱，间质胶原含量增多，肌节结构破坏;法舒地尔干预组较糖尿病组大鼠异常改变明显减轻。

2.4.3 Masson染色结果:糖尿病组大鼠心肌间质及血管周围胶原为11.23%±0.63%显著高于对照组的3.34%±0.45%(p＜0.01)。法舒地尔干预组为3.31% ±0.23%显著低于糖尿病组(p＜0.01)(图1)。

2.5 心肌SOD活力、MAD含量和MCC含量

糖尿病组大鼠心肌组织的SOD活力显著低于对照组(p＜0.01);法舒地尔干预组SOD活力显著高于糖尿病组(p＜0.01)，但仍低于对照组(p＜0.05)。糖尿病组MDA含量显著高于对照组(p＜0.01)，法舒地尔干预组MDA含量显著低于糖尿病组(p＜0.05)。糖尿病组大鼠的心肌胶原含量显著高于对照组(p＜0.01)。法舒地尔干预组显著低于糖尿病组(p＜0.01)(表2)。

2.6 心肌eNOS免疫组化染色结果

糖尿病组大鼠心肌eNOS阳性反应率为67.25%±12.13%显著低于对照组的103.78%±9.75%，(p＜0.01);法舒地尔干预组为94.56% ±10.23%显著高于糖尿病组(p＜0.05)(图2)。

2.7 磷酸化MYPT1水平

糖尿病组大鼠心肌组织中p-MYPT1显著高于对照组(p＜0.01)，法舒地尔干预组大鼠心肌组织中p-MYPT1显著低于糖尿病组(p＜0.01)(图3)。

图1 NC组、DM组和DF组的Masson染色结果Fig 1 The myocaidial in masson-stained of control group(NC)，diabetes group(DM)and diabetes with fasudil group(DF)［magnification(×400)］

图2 NC组、DM组和DF组的eNOS免疫组化结果Fig 2 Immunohistochemistry staining for eNOSin the heart of control group(NC)，diabetes group(DM)and diabetes with fasudil group(DF)［magnification(×400)］

图3 NC组、DM组和DF组大鼠心肌p-MYPT1的水平Fig 3 The level of myocardial p-MYPT1 protein expression in control group(NC)，diabetes group(DM)and diabetes with fasudil group(DF)(n=8)

3 讨论

心脏的氧化应激、炎性反应和心肌纤维化以及心肌细胞凋亡促使了DC的形成［8］。氧化应激是指活性分子如活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的过度生成增加或清除减少而抗氧化酶如SOD活性减少所致。MDA为脂质过氧化物产物可间接反映出机体细胞受自由基攻击的严重程度［9］。eNOS可减缓心肌损伤后的心肌重塑，发挥心肌保护作用。本研究结果显示糖尿病大鼠心肌组织的MDA含量增加，而SOD活力降低，eNOS表达明显减少，表明心肌在高糖环境中氧化应激增强，保护效应减弱，导致了心肌损害和间质胶原增生等组织结构改变。

Rho蛋白为小分子鸟苷酸结合蛋白，它能结合并水解鸟苷酸，使其在活性型(GTP结合)与失活型(GDP结合)之间循环从而起着“分子开关”的作用。ROCK是最早发现、最具特色的RhoA下游效应器。RhoA/ROCK信号通路调节着细胞的收缩、黏附、增殖和凋亡等多种生物学行为和功能。目前广泛应用的ROCK抑制剂主要有法舒地尔和Y-27632，法舒地尔是目前唯一可以应用于临床的ROCK抑制剂。它们主要作用于ROCK的ATP依赖的激酶区域，从而抑制ROCK的活性。研究发现糖尿病使心肌RhoA上调，导致ROCK的底物磷酸化水平升高，增加了肌动蛋白微丝骨架的聚合，致使心肌收缩功能受损，引发心肌功能障碍，抑制ROCK可以改善其心肌功能［10］。糖尿病肾病的研究证实，ROCK抑制剂是通过抗氧化作用抑制糖尿病肾纤维化［11］。ROCK活性增强可以通过抑制eNOSmRNA生成而使eNOS的表达下调，而ROCK抑制剂可以上调eNOS的表达［12］，这与本实验的研究结果一致。这些结果表明高血糖激活了心肌RhoA/ROCK信号通路，参与了氧化应激过程，同时下调了心肌细胞保护因子eNOS表达，导致了心肌纤维化的发生。

本研究证实了RhoA/ROCK信号通路在2型糖尿病大鼠心肌氧化应激和纤维化中的作用以及法舒地尔的心肌保护效应，为更好地理解和治疗糖尿病心肌病变提供了可能的理论依据。

［1］刘丽华，房彩霞，邓永贵，等．JNK信号通路介导高糖诱导的大鼠心肌成纤维细胞［J］．基础医学与临床，2013，33:200－201．

［2］Aksakal E，Akaras N，Kurt M，et al．The role of oxidative stress in diabetic cardiomyopathy:an experimental study［J］．Med Pharmacol Sci，2011，15:1241 －1246．

［3］Umar S，vander Laarse A．Nitric oxide and nitric oxide synthase isoforms in the normal，hypertrophic and failing heart［J］．Mol Cell Biochem，2010，333:191－201．

［4］Zhou H，Li YJ．Long-term diabetic complications may be ameliorated by targeting Rho kinase［J］．Diabetes Metab Res Rev，2011，27:318 －330．

［5］Mihtante JD，Lombardini JB，Schaffer SW，et al．The role of tanrine in the pathogenesis of the cardiomyopathy of insulin dependent diabetes mellitus［J］．Cardiovasc Res，2002，46:393－402．

［6］ Zhou H，Li YJ，Wang M，et al．Involvement of RhoA/ROCK in myocardial fibrosis in a rat model of type 2 diabetes［J］． Acta Pharmacologica Sinica， 2011， 32:999－1008．

［7］DeFronzo RA，Tobin JD，Andres R．Glucose clamp technique:a method for quantifying insulin secretion and resistance［J］．Am JPhysiol，1979，237:214 －223．

［8］Van Linthout S，Spillmann F，Riad A，et al．Human apolipoprotein A－I gene transfer reduces the development of experimental diabetic cardiomyopathy［J］．Circulation，2008，117:1563－1573．

［9］Yoshida H，Kisugi R．Mechanisms of LDL oxidation［J］．Clinica Chimica Acta，2010，411:1875 －1882．

［10］Soliman H，Craig GP，Nagareddy P，et al．Role of inducible nitric oxide synthase in induction of RhoA expression in hearts from diabetic rats［J］．Cardiovasc Res，2008，79:322－330．

［11］GoJO A，Utsunomiya K，Taniguchi K，et al．The Rho-kinase inhibitor，fasudil，attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats［J］．Eur J Pharmacol，2007，568:242－247．

［12］Gojo A，Utsunomiya K，Taniguchi K，et al．Rho-kinase mediates hypoxia-induced downregulation of endothelial nitric oxide synthase［J］．Circulation，2002，106:57－62．