郭利华，邵晓娜，朱华陀，陈文果，李 岚，虞朝辉，陈李华

(浙江大学医学院附属第一医院消化内科，浙江杭州310003)

1α，25(OH)2D3对多种肿瘤细胞具有潜在的抗增殖作用，流行病学以及细胞体外实验研究结果发现活性维生素D3可以调节结肠癌、乳腺癌、前列腺癌细胞周期、细胞侵袭、诱导细胞凋亡、促进细胞分化的作用［1－3］。1α，25(OH)2D3的目的基因包括细胞周期调节因子P21、P27、cyclins、细胞间黏附、侵袭抑制因子以及编码细胞骨架蛋白等［4］。本研究的目的是观察1α，25(OH)2D3对胃癌细胞增殖、细胞周期的影响，阐述1α，25(OH)2D3发挥抗增殖作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901细胞(中国科学院上海细胞库);RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶和澳洲胎牛血清(Gibco公司);1α，25(OH)2D3、MTT和DMSO(Sigma公司);Trizol、PI染料和 RNA酶(Sangon公司);PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR® PrimeScriptTM(Takara公司)。

1.2 细胞培养

采用含10%牛血清的RPMI 1640培养基培养BGC-823、SGC-7901人胃癌细胞系，在37℃，含5%CO2、湿度100%恒温孵育箱中培养。2～3 d后，加2 mL 0.25%胰蛋白酶消化3 min，加等体积的培养液终止消化，1 000×g离心5 min。

1.3 MTT细胞增殖检测

细胞以2 000个/孔种植于96孔板，4 h后，各组细胞加入不同浓度的1α，25(OH)2D3(1 ×10－10、1×10－9、1×10－8和 1 ×10－7mol/L)并设置阴性对照，每组4个复孔。细胞培养72 h后，每孔加20μL的MTT(5 g/L)，培养箱中继续培养4 h;吸取上清，每孔加150μL DMSO，室温下摇床上摇晃10 min，用酶标仪检测490 nm的A值。计算生长抑制率=［(A实验组－A对照组)/A对照组］×100%。

1.4 细胞周期检测

将BGC-823和SGC-7901细胞用无血清的培养基以(4～5)×105个/孔铺于6孔板，24 h后更换含10%胎牛血清的培养基，加入终浓度为100 nmol/L的1α，25(OH)2D3，对照组加入等量的 RPMI1640培养基，继续培养72 h。细胞用0.5%胰蛋白酶消化，接着用PBS洗2次，每次1 000×g离心5 min;弃上清后用预冷的70%乙醇固定，4℃过夜;离心除去乙醇，PBS洗涤2次，然后加5uL的RNA酶(5 g/L)，室温下处理15 min;每管加5μL的PI(5 g/L)染料，室温避光孵育30 min;1 h内流式检测。应用ModFit LTTM软件分析细胞周期结果。

1.5 RT-qPCR

将BGC-823和SGC-7901细胞铺于6孔板，实验组加100 nmol/L 1α，25(OH)2D3继续培养，72 h之后，吸去培养基，每孔加1 mL Trizol(BBI)抽提Total RNA，采用NanoDrop® ND-2000测定RNA浓度和纯度，根据RNA浓度结果将各组调成一致的浓度，再应用 RT试剂(Takara)将 RNA反转录成cDNA。定量PCR引物如下:内参GAPDH引物:上游 5'-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'，下游 5'-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3';P21引物:上游5'-AGGAAGACCATGTGGACCTGTCAC-3'，下游 5'-A CCAAATGCGTGTCCTCAGAGT-3';cyclin E1引物:上游 5'-GCAGTATCCCCAGCAAATC-3'，下游 5'-TCAA GGCAGTCAACATCCA-3';cyclin D1引物:上游5'-GCTGTGCATCTACACCGACAACTC-3'，下游 5'-AGG TTCCACTTGAGCTTGTTCACC-3';CDK6引物:上游5'-ATATCTGCCTACAGTGCCCTGTCTC-3'，下游 5'-G TGGGAATCCAGGTTTTCTTTGCAC-3'。定量PCR反应条件是:95℃预热2 min，95℃解链10 s，扩增:40循环95℃/10 s，60℃/34 s，72℃/15 s;扩增反应结束后，按95℃/10 s;60℃/60 s;95℃/15 s的反应条件建立PCR产物熔解曲线;数据采用2－△△CT法进行分析。

1.6 统计学分析

实验数据采用SPSS16.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，不同浓度间比较采用方差分析，多组间比较采用LSD分析。

2 结果

2.1 1α，25(OH)2D3 抑制 BGC-823、SGC-7901增殖

1×10－10～1×10－7mol/L 的1α，25(OH)2D3对BGC-823和SGC-7901胃癌细胞增殖均具有一定的剂量依耐性，不同浓度的1α，25(OH)2D3对细胞增殖抑制作用程度不同，而且随浓度升高抑制作用逐渐增强。1×10－8和1×10－7mol/L对 BGC-823和SGC-7901细胞增殖抑制率高于1×10－10mol/L(p＜0.05)(表1)。

2.2 1α，25(OH)2D3对胃癌细胞周期的影响

10－7mol/L 1α，25(OH)2D3干预胃癌细胞系72 h之后，流式细胞术 (flow cytometry，FCM)检测细胞周期分布情况，G0/G1期细胞比例较对照组明显增加(p＜0.05)，S期细胞比例下降(p＜0.05)，G2/M期细胞比例减少(p＜0.05)(表2，图1)。

2.3 RT-qPCR检测1α，25(OH)2 D3对细胞周期相关基因表达的影响

1×10－7mol/L 1α，25(OH)2D3处理 BGC-823和SGC-7901胃癌细胞72 h后，P21 mRNA表达升高，而cyclin D1、cyclin E1和CDK6 mRNA表达降低(p＜0.05)(图2)。

3 讨论

1α，25(OH)2D3是维生素D最主要的活性形式，近年来的流行病学研究数据表明血清25OHD水平与一些恶性肿瘤发病率呈负相关［5］;而且大量体外细胞实验研究证明，1α，25(OH)2D3对多种肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等活动具有一定程度地调节作用［6］。1α，25(OH)2D3结合到维生素 D 受体VDR，激活的VDR与维甲酸X受体(Retinoid X Receptor，RXR)形成VDR/RXR共因子，它结合到目的基因维生素D反应元件启动子区调节基因转录［7］。

表1 MTT法检测1α，25(OH)2 D3对胃癌细胞增殖的影响Table 1 The effect of 1α，25(OH)2D3 on gastric cancer cells proliferation was detected via MTT assay，n=3)

表1 MTT法检测1α，25(OH)2 D3对胃癌细胞增殖的影响Table 1 The effect of 1α，25(OH)2D3 on gastric cancer cells proliferation was detected via MTT assay，n=3)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group．

BGC-823 group SGC-7901 A490 nm inhibitor rate A490 nm inhibitor rate control 0.636±0.016 0.663±0.084 1×10－10 mol/L 0.567±0.025* 10.7% 0.603±0.039* 15.3%1×10－9 mol/L 0.561±0.015* 11.7% 0.589±0.036* 17.3%1×10－8 mol/L 0.523±0.031* 17.8%* 0.530±0.061＊＊ 25.5%＊＊1×10－7 mol/L 0.483±0.016＊＊ 24.0%＊＊ 0.462±0.0318＊＊ 35.2%＊＊

，n=3)表2 1，25(OH)2 D3对细胞周期的影响Table 2 The effect of 1α，25(OH)2 D3 on cell cycle

，n=3)表2 1，25(OH)2 D3对细胞周期的影响Table 2 The effect of 1α，25(OH)2 D3 on cell cycle

＊P ＜0.05 compared with control group．

cell lines group G0/G1 rate(%) Srate(%) G2/M rate(%)BGC-823 control 53.69±1.44 31.69±0.56 14.61±1.16 1，25D3 66.56±0.76* 24.17±1.25* 9.27±1.78*SGC-7901 control 69.38±0.64 23.14±0.96 7.48±0.87 1，25D3 77.29±1.33* 14.89±0.85* 8.49±0.79*

图1 流式检测1α，25(OH)2 D3对细胞周期的影响Fig 1 The effect of 1α，25(OH)2 D3 on the cell cycle was detected via Flow cytometry

图2 1α，25(OH)2 D3对细胞周期相关基因mRNA表达的影响Fig 2 The effect of 1α，25(OH)2 D3 on cell cycle-related genes mRNA expression，n=3)

1α，25(OH)2D3显著性抑制胃癌细胞增殖，并呈现浓度依赖性，1α，25(OH)2D3引起 BGC-823、SGC-7901胃癌细胞G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少。细胞周期结果表明1α，25(OH)2D3使细胞主要分布于DNA静止期G0/G1期，阻止其进入S期，诱导细胞周期阻滞，结果导致细胞周期延长，从而使细胞增殖减慢。

细胞周期各个时期由不同细胞周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)、CDK 抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)来调控所调控。正常细胞中，cyclin Dl与CDK4/CDK6先结合形成复合体，CDK4/CDK6发挥激酶活性使pRb磷酸化［8］，进入S期必需的转录因子 E2F从 Rb-E2F复合体中解离［9］;这促进cyclin E积累而刺激CDK2活性，从而激活另一些转录因子，使与DNA合成有关的基因表达，细胞即由G1期进入 S 期［10］。细胞在 1α，25(OH)2D3干预下将降低细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶表达阻碍细胞G1期进入S期［11］。除了周期蛋白和磷酸化对CDK活性进行调节外，CKI(如P2l)对CDK活性起负调控作用。P21能抑制包括cyclinE-CDK2在内的多种G1期Cyclin-CDK激酶活性，使细胞不能通过 G1期［12－14］。本研究中，胃癌细胞系 BGC-823、SGC-7901 在1α，25(OH)2D3干预后上调 CDK抑制蛋白P21 mRNA水平，下调周期蛋白cyclin D1、cyclin E1，下调周期蛋白依赖性激酶CDK6 mRNA水平，导致细胞阻滞于G1/S检测点，从而防止细胞过度增殖。

总之，本研究的结果提示1α，25(OH)2D3抗胃癌细胞增殖作用可能与其阻滞细胞周期、调节细胞周期相关蛋白表达有关。

［1］Sung V，Feldman D．1，25-Dihydroxyvitamin D3decreases human prostate cancer cell adhesion and migration［J］．Mol Cell Endocrinol，2000，164:133 －143．

［2］ Bessler H，Djaldetti M．1alpha，25-dihydroxyvitamin D3modulates the interaction between immune and colon cancer cells［J］．Biomed Pharmacother，2012，66:428 －432．

［3］Lopes N，Sousa B，Martins D，et al．Alterations in Vitamin D signalling and metabolic pathways in breast cancer progression:a study of VDR，CYP27B1 and CYP24A1 expression in benign and malignant breast lesions［J］．BMC Cancer，2010，10:483．

［4］Jensen SS，Madsen MW，Lukas J，et al．Inhibitory effects of 1alpha，25-dihydroxyvitamin D(3)on the G(1)-Sphasecontrolling machinery［J］．Mol Endocrinol，2001，15:1370－1380．

［5］Peters U，Hayes RB，Chatterjee N，et al．Circulating vitamin D metabolites，polymorphism in vitamin D receptor，and colorectal adenoma risk［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13:546－552．

［6］Vuolo L，Di Somma C，Faggiano A，et al．Vitamin D and cancer［J］．Front Endocrinol(Lausanne)，2012，3:58．

［7］Carlberg C，Quack M，Herdick M，et al．Central role of VDR conformations for understanding selective actions of vitamin D(3)analogues［J］．Steroids，2001，66:213 － 221．

［8］Deshpande A，Sicinski P，Hinds PW．Cyclins and cdks in development and cancer:a perspective［J］．Oncogene，2005，24:2909－2915．

［9］Harbour JW，Dean DC．The Rb/E2F pathway:expanding roles and emerging paradigms［J］．Genes Dev，2000，14:2393－2409．

［10］Coqueret O．Linking cyclins to transcriptional control［J］．Gene，2002，299:35－55．

［11］Artaza JN，Sirad F，Ferrini MG，et al．1，25(OH)2vitamin D3inhibits cell proliferation by promoting cell cycle arrest without inducing apoptosis and modifies cell morphology of mesenchymal multipotent cells［J］．J Steroid Biochem Mol Biol，2010，119:73 －83．

［12］Owa T，Yoshino H，Yoshimatsu K，et al．Cell cycle regulation in the G1phase:a promising target for the development of new chemotherapeutic anticancer agents［J］．Curr Med Chem，2001，8:1487－1503．

［13］Polyak K，Lee MH，Erdjument-Bromage H，et al．Cloning of p27Kip1，a cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals［J］．Cell，1994，78:59 －66．

［14］Campanini F，Santucci MA，Brusa G，et al．Expression of P21(WAF1/CIP1/SID1)cyclin-dependent kinase inhibitor in hematopoietic progenitor cells［J］．Gene，2001，273:173－180．