刘琳，廖子龙，徐赢东，魏鑫，王晓鸥，樊华

（中国医科大学附属第一医院血液内科，沈阳 110001）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是造血干细胞在增殖分化过程中发生增殖失控、分化成熟障碍、凋亡受阻大量蓄积于造血器官引起的恶性克隆性疾病，发病受多种因素的影响［1］。胰岛素样生长因子结合蛋白 3（insulin＆x100ccf;like growth factorbinding protein 3，IGFBP3）是胰岛素样生长因子信号通路中的一员，基因定位于7p12＆x100ccf;14，含有5个外显子，mRNA长2.4 kb，表达的蛋白由264个氨基酸残基（含18个半胱氨酸）组成，分子量为29 kd［2］。IGFBP3蛋白在血清中一方面可以与胰岛素样生长因子（insulin＆x100ccf;like growth factors，IGFs）结合，抑制IGFs与胰岛素样生长因子结合蛋白受体（insulin＆x100ccf;like growth factors＆x100ccf;R，IGF＆x100ccf;R）的结合，抑制IGF＆x100ccf;R激活后所具有的促进细胞增殖、转移和抗凋亡作用；另一方面也可以不依赖IGF直接与细胞中的受体（如维生素D受体、RXRα受体、TGF＆x100ccf;β受体等）结合，调控细胞的生长、代谢、分化、增殖［3］。近年来，越来越多的研究集中在IGFBP3对肿瘤细胞的影响上。这些研究以实体瘤为主，它的表达及作用可能因肿瘤的种类、特点、微环境的不同而不同［4，5］，而对IGFBP3在恶性血液病中的作用研究存在不足，也有一些文献提到在急性淋巴细胞白血病中血清蛋白水平减低［6］，甚至一些人将IGFBP3血清蛋白水平作为评估预后的指标。但是关于其在AML中，表达和作用尚不清楚。本研究试图在AML患者血清中检测IGFBP3蛋白水平，评估其临床相关性，为探讨AML的发病机制和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2013年3月至2014年1月在我院血液科门诊、住院确诊的32例初治AML患者的血清标本，根据FAB分型标准，M1 1例、M2 10例、M3 4例、M4 1例、M5 15例、未分化白血病1例；完全缓解（complete remission，CR）组 22例；对照组 14例，为骨髓象正常的非恶性血液病患者，其中糖尿病患者4例、肾功能不全3例、正常供者5例，免疫性血小板减少患者2例。均取得了患者的知情同意。

1.2 材料

IGFBP3 ELISA试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司，紫外分光光度计（450 nm）UV765由上海精密仪器仪表有限公司购得，离心机TG16W由上海领成生物科技有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 提取外周血血清：在患者清晨空腹状态下采用黄色促凝管抽取外周血4～6 mL，随后将新鲜标本放于离心机中，3 000 r/min转速下离心10 min，吸取1 mL淡黄色上清留置于1.5 mL无菌EP管中，放入-80冰箱冻存。

1.3.2 ELISA法测定IGFBP3血清蛋白水平：68例样品使用前完全解冻，取出96孔板，向其中5个孔槽中加入不同浓度标准品各50 μL，随后向其余孔槽加入68例样品各10 μL，再加入稀释液40 μL，余下孔槽做空白对照，再向各个孔槽加入IGFBP3抗体100 μL，37避光孵育1 h，取出孔板，向各个孔槽加入A、B底物各50 μL，再次37避光孵育1 h，随后加入终止液50 μL。450 nm紫外分光光度计测定各个样品及标准品的吸光度（OD值）并得到标准品的浓度梯度方程（图1），再将吸光度代入方程中计算实际浓度，每个样品重复测定3次。

图1 IGFBP3蛋白的浓度梯度曲线Fig.1 Concentration gradient curve equation of IGFBP3 protein

1.4 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件分析数据，3组的ELISA结果的浓度值均用±s表示，采用单因素方差分析比较组间差异，独立样本t检验比较均值；P＆lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA结果

ELISA法测定68例外周血血清中IGFBP3蛋白水平，并比较3组蛋白水平的差异，结果见表1、图2。

表1 急性髓系白血病患者IGFBP3蛋白水平（±s）Tab.1 Serum IGFBP3 protein expression levels in AML patients（±s）

表1 急性髓系白血病患者IGFBP3蛋白水平（±s）Tab.1 Serum IGFBP3 protein expression levels in AML patients（±s）

1）P＆gt;0.05 compare to normal；2）P＆lt;0.05 compare to normal.

Group n Protein level（μg/mL）P Normal 14 0.877 5±0.603 0 CR 22 0.862 5±0.399 8 0.881）De novo AML 32 0.533 7±0.255 0 0.0012）

图2 急性髓系白血病患者蛋白水平Fig.2 Serum IGFBP3 protein levels in AML patients

2.2 初治AML患者IGFBP3血清蛋白水平与临床特征的关系

SPSS 17.0统计分析软件分析不同年龄（≥60岁、＆lt;60岁）、性别（男、女）、FAB分型（M2、M3、M5）之间的相关性，见表2，未发现上述各种临床因素与IGFBP3血清蛋白水平有明显相关性。

3 讨论

AML是一组造血干细胞恶性克隆性疾病，占成人急性白血病的70%以上，总体预后差，3年无病生存仅30%。发病机制不明。越来越多的研究表明，细胞遗传学和分子遗传学异常与AML的发生发展密切相关，可以作为诊断、预后评估以及个体化治疗的分子标志［7］。

IGFBP3含有3个结构域，N末端、C末端、中间可变结构域，通过N末端的富含半胱氨酸的GCGC＆x100ccf;CXXC保守序列识别IGFs，通过含有6个半胱氨酸的C末端结合IGFs，形成U形结构，竞争性抑制IGFs与IGF＆x100ccf;R结合，进而抑制IGF＆x100ccf;R信号传导，抑制下游的丝裂原激活蛋白激酶（mitogen＆x100ccf;activatedprotein kinase，MAPK）途径和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3＆x100ccf;kinase，P13K）途径激活［8］，抑制肿瘤增殖。在对K562细胞株的研究中发现c＆x100ccf;myc基因通过抑制IGFBP3的表达促进细胞增殖［9］。在HL＆x100ccf;60、U937细胞株研究中发现IGFBP3可以与维甲酸受体（RAR receptor/RXR receptor，RAR/RXR）作用抗白血病细胞增殖［10］。所以我们可以推测，IGFBP3可能在AML的发病中起一定作用。同时，越来越多的研究表明，AML的发生与范可尼通路（Fanconi pathway，FA pathway）异常有关，如FANCG、BRCA1等在白血病细胞中的异常表达均提示可能促进白血病的发生［11，12］。2012年的一项研究发现范可尼贫血肿瘤相关通路的基因集富集分析中发现核心富集基因IGFBP、纤维母细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）、D4S23E等与肿瘤形成及耐药相关，进一步提示了它的表达异常可能与白血病的发生有关［13］。

表2 急性髓系白血病患者IG FBP3蛋白与临床特征相关性Tab.2 Relations between IGFBP3 protein levels and the clinical features in de novo AML patients

基于上述文献报道，为了推测IGFBP3是否与成人AML的发生有关，我们检测AML患者血清的IGFBP3蛋白水平。

本研究我们发现，初治组血清IGFBP3蛋白水平减低，CR组和对照组均明显高于初治组。由此我们推测IGFBP3可能作为一种具有抑癌作用的蛋白在AML的发病中起到一定作用，它在血清中水平下降也有可能参与AML的发生。CR患者中，该蛋白水平与对照组无显著性差异。我们推测，IGFBP3还可以作为一种反映疗效的指标判断AML的治疗效果。

虽然已经证实了IGFBP3有抑癌作用，但是对于IGFBP3减低的机制还有待研究。近来的一项研究发现IGFBP3同其他通路的相互作用参与了细胞的凋亡、自噬、DNA修复过程［14］，由此我们可以看出，IGFBP3蛋白可能与其他通路相互作用，影响血清IGFBP3蛋白的含量。还有一些文章提到，IGFBP3蛋白的减低还可能与肿瘤细胞中其基因表达减低有关，如一项胃癌的研究提到IGFBP3在实体瘤细胞中表达减低可能与它的启动子区域＆x100ccf;202位点CPG岛异常甲基化状态有关［15，16］，一项针对结肠肿瘤的Meta分析提到IGFBP3的表达减低与＆x100ccf;202位点与甘氨酸32丙氨酸的突变有关，在前列腺癌的研究中，这些突变还影响血清中IGFBP3蛋白水平，但是这些表达减低的机制还不明确。所以，加深IGFBP3基因水平及其影响因素的研究尤为重要，这也是我们今后研究的方向。

综上所述，IGFBP3作为胰岛素样生长因子信号通路中的一员，越来越引起人们的关注。对AML的发病具有一定的作用。所以，进一步加深此基因在AML的表达调控机制的研究，不仅可以使AML发病机制的研究更为全面，还可以为治疗提供新的靶点。

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