徐宝宁，张磊，田大力

（中国医科大学附属第四医院胸外科，沈阳 110032）

世界范围内肺癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首，2008年世界范围内肺癌的新发病例为160万，肺癌所致死亡病例达140万［1］。非小细胞肺癌（non＆x100ccf;small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的最主要分型，约占全部肺癌的85%［2］。然而，大多数肺癌的早期症状并不特异。大约10%的患者在确诊时尚无任何症状。对于NSCLC而言，约50%的患者在确诊时已有转移而失去了手术的机会［3］。研究NSCLC肿瘤标记物对NSCLC的早期诊断、预后分析以及研究靶向治疗均有重要意义。

RhoA蛋白是小分子G蛋白Rho家族成员之一，参与细胞骨架的组装、细胞黏附、细胞运动、细胞周期进展、细胞分裂及基因转录等多种生命过程的调节［4］。研究证实，Rho家族成员在胃癌、肝癌、食管癌和卵巢癌等多种癌组织中存在过度表达，并且与肿瘤的侵袭、转移密切相关［5～8］。本课题组在前期研究中发现，RhoA mRNA在肺腺癌中高表达，且与肺腺癌的淋巴结转移和临床病理分期（tumor node metastasis，TNM）密切相关［9］。我们推测RhoA蛋白可能是NSCLC的肿瘤标记物，参与了NSCLC的发生发展过程。

本研究拟采用免疫组织化学法检测RhoA蛋白在NSCLC组织及其对应的癌旁肺组织中的表达水平，探讨其表达与NSCLC临床病理资料的关系，并分析其与NSCLC预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

组织标本来自中国医科大学附属第四医院行肺癌切除手术的78例患者。其中，肺腺癌42例，肺鳞癌36例。同时在78例对应的癌旁肺组织中随机选取30例，作为对照组。排除手术后1个月内死亡以及有其他脏器转移、有其他肿瘤史以及术前接受过放化疗及其他生物治疗的患者。78例NSCLC中，男43例，女35例。年龄38～83岁，平均年龄61.47岁。根据世界卫生组织（WHO）2009年对恶性肿瘤判定标准的第7次修订［10］，对78例NSCLC患者分期分化进行判定。本研究已经获得中国医科大学伦理委员会批准并与患者签署了知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色方法

手术切除的肺癌组织标本在甲醛中固定，石蜡包埋，3 μm连续切片。二甲苯和梯度乙醇脱蜡后，置于0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液（pH6.0）高压锅沸腾3.0 min。应用抗人RhoA的单克隆抗体（abcam公司：ab54835）进行免疫组织化学染色。简要步骤如下：滴加抗RhoA抗体（1∶200稀释）后，切片置于4过夜，PBS冲洗3次后滴加二抗生物素化鼠/兔抗IgG（迈新公司：KIT＆x100ccf;9710）。DAB（迈新公司：KIT＆x100ccf;0017）染色后苏木素复染。

1.3 免疫组织化学染色结果判定

RhoA蛋白的染色强度分为0分（无着色），1分（淡黄色），2分（黄色），3分（黄褐色）。着色面积百分比划分为1分（≥1%～≤25%着色），2分（＆gt;25%～≤50%着色），3分（＆gt;50%～≤75%着色），4分（＆gt;75%～≤100%着色）。每个组织样本的染色强度与百分比得分相乘后得出0～12分。规定组织表达为（-）：0分；（+）：1～4分；（++）：5～8分；（+++）：9～12分。（-）～（+）的组织样本视为低表达样本，（++）～（+++）的组织样本视为高表达样本。

1.4 统计学分析

用SPSS17.0统计软件进行统计分析，χ2检验验证RhoA蛋白的表达与不同病理分型、性别、年龄、分化、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期的关系；应用Kaplan＆x100ccf;Meier预后分析法，判定RhoA蛋白的表达与患者预后的关系。P＆lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoA蛋白在NSCLC及癌旁肺组织中的表达

应用免疫组化法检测RhoA蛋白在NSCLC及癌旁肺组织中的亚细胞定位以及表达情况。RhoA蛋白阳性表达物质定位于上皮细胞胞质内，胞膜、胞核和间质细胞中无发现，胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞（图1）。结果显示：RhoA蛋白在51例（65.4%）NSCLC组织中呈高表达，其中包括27例（64.3%）肺腺癌，24例（66.7%）肺鳞癌；在3例（10.0%）癌旁肺组织中高表达。RhoA蛋白在NSCLC组织中的表达率显著高于癌旁肺组织（P＆lt;0.05），而在肺鳞癌和肺腺癌中的表达率无统计学差异（P＆lt;0.05）。见表1。

2.2 RhoA蛋白的表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

为了进一步探讨RhoA蛋白在NSCLC发生发展过程中所扮演的角色，分析了78例NSCLC组织中RhoA蛋白的表达与临床病理特征的关系。统计结果显示：RhoA蛋白在NSCLC组织中的表达与淋巴结转移以及TNM分期相关（P＆lt;0.05）；与年龄、性别、分化、肿瘤大小无关（P＆gt;0.05）。见表2。

图1 免疫组化标记R hoA蛋白在非小细胞肺癌及癌旁肺组织中的表达情况 ×200Fig.1 Immunohistochemical staining of RhoA protein in NSCLC and para carcinoma tissues ×200

表1 R hoA蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况Tab.1 Differential expression of RhoA protein in NSCLC tissue specimens

2.3 RhoA蛋白的表达与NSCLC患者无瘤生存期和总生存期的关系

Kaplan＆x100ccf;Meier分析结果发现：RhoA蛋白高表达组患者的无进展生存期显著低于RhoA蛋白低表达组（图2A）。RhoA蛋白低表达组的患者的总生存期显著高于RhoA蛋白高表达组（图2B）。表明RhoA蛋白高表达提示NSCLC患者预后不良。

表2 R hoA蛋白的表达与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系Tab.2 Association of RhoA expression with clinicopathological features from NSCLC

图2 R hoA蛋白的表达与非小细胞肺癌患者无进展生存期（A）和总生存期（B）的关系Fig.2 Association of RhoA protein expression with event free（A）and overall（B）survival of patients with NSCLC

3 讨论

本研究采用免疫组化法分析了RhoA蛋白在78例NSCLC组织和30例癌旁肺组织中的表达情况。结果发现，RhoA蛋白在肺鳞癌和肺腺癌组织中均呈现高表达，在癌旁肺组织中呈现低表达。RhoA蛋白与NSCLC患者的淋巴结转移情况、TNM分期以及预后显著相关。因此，RhoA蛋白是NSCLC潜在的重要的生物学指标。

Rho蛋白是一种具有GTP酶活性的小分子G蛋白（small G proteinase，GTPase），主要包括 Rho、Rae、Cdc42 3个亚家族，至少包括23个成员。RhoA是小分子G蛋白Rho家族成员之一［4］。有活性的RhoA可以激活其下游的ROCK，PIP5K，MDIAL等蛋白，最终调节G＆x100ccf;actin与F＆x100ccf;actin之间的转换，进而影响细胞形态和细胞运动能力。RhoA过表达能增加细胞的迁移侵袭和转移能力［11］。有研究报道，应用小干扰RNA沉默RhoA表达并构建重组质粒，可以对乳腺癌细胞系的侵袭及转移有显著抑制作用［12］，提示RhoA可能在恶性肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用。

本课题组前期在基因水平的研究中发现，肺腺癌中RhoA mRNA表达水平显著高于对应癌旁肺组织［9］。本研究首次从蛋白水平完整报道了RhoA蛋白在NSCLC组织中的表达情况、与临床病理资料的关系以及与患者预后的关系。我们推测，RhoA蛋白在NSCLC中的角色与在胃癌、肝癌、食管癌、卵巢癌等多种癌组织中的角色相近，通过增强肿瘤细胞运动能力，使肿瘤细胞侵袭转移能力增强，肿瘤细胞表现出更强的淋巴结转移和远处转移能力，终使患者的无进展生存期和总生存期均显著缩短。值得注意的是，目前尚未明确RhoA基因发生异常表达的根本原因，可能存在相关变异的基因序列也未得到阐述。进一步在基因层面研究RhoA异常表达的原因，以及研究RhoA蛋白参与肿瘤发生发展的生物学机制，研制针对变异基因或RhoA蛋白参与的致癌通路的阻止药物，对RhoA相关的恶性肿瘤的治疗有重要意义。

目前，虽然规范化的放化疗和免疫治疗可以改善进展期NSCLC患者的生存质量，延长患者生存时间［13，14］，但进展期NSCLC患者的中位生存期只有1年，5年生存率仅有3.5%［15］。寻找NSCLC有效的治疗靶点，对患者进行个体化的靶向治疗，已成为治疗NSCLC的新方向。本研究结果表明，RhoA可能在NSCLC的发生侵袭转移过程中发挥重要作用，RhoA可否成为NSCLC有效的治疗靶点有待于进一步深入研究。

［1］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

［2］Goldstraw P，Crowley J，Chansky K，et al.The IASLC lung cancer staging project：proposals for the revision of the TNM stage groupings in the forthcoming（seventh）edition of the TNM Classification of malignant tumours［J］.Thorac Oncol，2007，2（8）：706-714.

［3］Haithcock BE，Stinchcombe TE，Socinski MA.Treatment of surgically resectable non＆x100ccf;small＆x100ccf;cell lung cancer in elderly patients［J］.Clin Lung Cancer，2009，10（6）：405-409.

［4］Aspenstrom P，Ruusals A，Pacholsky D.Taking Rho GTPases to the next level：the cellular functions of atypical Rho GTPases［J］.Exp Cell Res，2007，313（17）：3673-3679.

［5］苏晓娟，唐志峰，李强，等.RhoA和核因子ΚB在胃癌中的表达及其临床意义［J］.中华肿瘤杂志，2011，33（4）：426-429.

［6］Li XR，Ji F，Quyang J，et al.Overexpression of RhoA is associated with poor prognosis in hepatocellular earcinoma［J］.Eur J Surg Oncol，2006，32（10）：1130-1134.

［7］Faried A，Nakajinla M，Sohda M，et al.Correlation between RhoA overexpression and tumour progression in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Eur J Surg Oncol，2005，31（4）：410-414.

［8］Chen S，Wang J，Gou WF，et al.The involvement of RhoA and Wnt＆x100ccf;5a in the tumorigenesis and progression of ovarian epithelialcarcinoma［J］.Int J Mol Sci，2013，14（12）：24187-24199.

［9］徐宝宁，姜文军，田大力.人肺腺癌中RhoA的表达及临床意义［J］.中国医科大学学报，2014，1（2）：49＆x100ccf;52.

［10］Sobin LH，Gospodarowicz MK，Wittekind C，et al.TNM classification of malignant tumours［M］.7th ed.West Sussex：Wiley，2009.

［11］Vega FM，Fruhwirth G，Ng T，et al.RhoA and RhoC have distinct roles in migration and invasion by acting through different targets［J］.J Cell Biol，2011，193（4）：655-665.

［12］Pille JY，Denoyelle C，Varet J，et al.Anti＆x100ccf;RhoA and anti＆x100ccf;RhoC siRNAs inhibit the proliferation and invasiveness of MDA＆x100ccf;MB＆x100ccf;231 breast cancer cells in vitro and in vivo［J］.Mol Ther，2005，11（2）：267-274.

［13］Stinchcombe TE，Lee CB，Socinski MA.Current approaches to advanced＆x100ccf; stage non＆x100ccf;small＆x100ccf;cell lung cancer：first＆x100ccf;line therapy in patients with a good functional status［J］.Clin Lung Cancer，2006，7（Suppl.4）：S111-S117.

［14］Thomas A，Hassan R.Immunotherapies for non＆x100ccf;small＆x100ccf;cell lung cancer and mesothelioma［J］.Lancet Oncol，2012，13（7）：e301-e310.

［15］Aisner DL，Marshall CB.Molecular pathology of non＆x100ccf;small cell lung cancer：a practical guide［J］.Am J Clin Pathol，2012，138（3）：332-346.