刘 苏，张胜利

（1.安徽农业大学 植物保护学院，安徽 合肥 230036;2.亳州师范高等专科学校 理化系，安徽 亳州 236800）

自然界中几乎所有的生物都表现出以24 h为周期的昼夜节律现象。生物节律受到一系列生物钟基因的调控，包括 period，timeless，clock，cycle以及“cryptochrome等［1-2］。隐花色素基因（cryptochrome，简称cry）编码的CRY蛋白是一类蓝光受体，参与生物体内的光介导过程以及生物钟的形成［3］。CRY的氨基酸序列与DNA光解酶具有较高的相似性，但CRY并无DNA光解酶对DNA嘧啶二聚体的修复活性［3］。CRY普遍存在于动植物及微生物中，但其所行使的功能并不相同:植物CRY是一种对光敏感的蓝光受体;哺乳动物（如小鼠）有2个CRY，但它们对光线并不敏感，而具有转录抑制活性;昆虫体内同时具有光受体型CRY（CRY1）和转录抑制型CRY（CRY2）［2-3］。此外，人们发现昆虫存在3种不同的生物钟调控机制:只含有CRY1的调控机制（以果蝇Drosophila melanogaster为代表）、只含有CRY2（以蜜蜂Apis mellifera为代表）的调控机制以及CRY1和CRY2共同参与的调控机制（以帝王斑蝶Danaus plexippus为代表）［4］。

由于节律行为会影响昆虫的各种生理过程，例如交配、产卵、滞育以及对杀虫剂的忍耐力等，因此cry基因引起了研究者的极大兴趣。当前，一些模式昆虫的cry基因已被克隆，并且其功能也已被深入研究［4-6］。此外，通过体外蛋白表达以及RNA干扰等手段，人们对一些非模式昆虫的CRY的功能也进行了研究。例如，沉默豆缘蝽（Riptortus pedestris）的cry2v基因之后，试虫表现出紊乱的节律行为，同时体壁的周期性合成也受到干扰［7］。又如，海灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）的cry1和cry2在触角嗅觉感器之中大量表达，暗示它们与昆虫嗅觉的周期性波动相关［8］。

二化螟（Chilo suppressalis）属鳞翅目螟蛾科（Lepidoptera:Pyralidae），是水稻的重要害虫之一［9］。此虫多在夜间活动，且对光线具有一定的敏感性，因此，推测其cry基因可能与其昼夜节律有关。本研究克隆了2个二化螟隐花色素基因（命名为Cs-cry1和Cs-cry2），并对其分子特性进行分析，以期进一步了解二化螟生物钟的调控机制，为二化螟的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试二化螟幼虫采集自合肥市郊区水稻田。幼虫在实验室中用TN1水稻苗饲养备用。饲养条件为:温度26±1℃，相对湿度75%，光照:黑暗=16∶8h。幼虫化蛹后，转移至聚丙烯塑料饭盒（15×15×10cm）内待其羽化。羽化的成虫以15%蜂蜜水饲喂。

1.2 分子克隆

取二化螟1～3日龄成虫，置于冰上解剖触角、头部、胸、腹、足和翅等不同组织，并将各组织分别置液氮中研磨成粉末后，用RNAiso Plus试剂（宝生物公司，大连）提取总RNA。取2 μg头部组织的总RNA，用PrimeScript 1st-strand反转录试剂盒（宝生物公司，大连）合成第一链cDNA。根据Genbank上登录的鳞翅目cry1和cry2分别设计简并引物（cry1-F:5’-TGCTTYGAGCARGAYTGYGAGC-3’，cry1-R:5’-ACCCACATCCAGTTRCCRGCGCA-3’;cry2-F:5’-GARTGGGGWACHACRGCGTTRAC-3’，cry2-R:5’-CCAYGGYTCRTGKATRTACCGCGT-3’），用于扩增二化螟Cs-cry1和Cs-cry2的部分保守序列。随后，根据得到的保守序列再设计基因特异性引物，采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得基因的5’和3’区域。所用引物为 cry1-5race:5’-GTGGAAGACAGTCGACCTTGGTGT-3’，cry1-3race:5’-CTCAACGTGGAGTACGAGACATTC-3’;cry2-5race:5’-CTCGTCGATAAACATCCAAACCTC-3’，cry2-3race:5’-CACCACTCCAATAGCTGACGATC-3’。RACE使用宝生物公司的5’-RACE和3’-RACE试剂盒进行操作。PCR扩增均使用Tks Gflex DNA聚合酶（宝生物公司，大连）进行，扩增产物经由1%琼脂糖凝胶电泳分析，切下目的条带回收纯化后，送上海Invitrogen生物公司测序。

1.3 生物信息学分析

简并引物PCR以及RACE扩增所获得的序列使用DNAman软件进行拼接;序列一致性分析以及同源基因的搜索使用 NCBI的BLAST 程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）;蛋白质理论等电点和分子量的计算使用ExPASy的ProtParam程序（http://web.expasy.org/protparam）;蛋白质保守结构域与关键催化氨基酸的确定使用NCBI的CDD数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）;二化螟Cs-cry1和Cs-cry2编码的蛋白连同其它昆虫的CRY一并提交至Clustal Omega服务器（http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo）进行多序列连配，连配结果导入MEGA5.05软件（http://www.megasoftware.net），以邻接法构建进化树，分支置信度经1000次自举重复测验。

1.4 组织表达谱分析

使用半定量RT-PCR分析二化螟Cs-cry1和Cs-cry2基因在不同组织内的表达谱。取2 μg来源于二化螟触角、头部、胸、腹、足和翅等不同组织的RNA，使用PrimeScript 1st-strand反转录试剂盒合成第一链cDNA，并将所有cDNA样品用去离子水稀释至100 ng/μL。RT-PCR引物为:cry1-F:5’-CTGGAT-GTGGGTATCTTCAT-3’，cry1-R:5’-CATTTCAATCATGTCATGACT-3’;cry2-F:5’-GTTACAAAGACCGAATGTCAT-3’，cry2-R:5’-GTCTCGATGTGTGAATGTTCAT-3’，使用二化螟的18S rRNA基因作为内参基因（引物为18S-F:5’-TCGAGCCGCACGAGATTGAGCA-3’，18S-R:5’-CAAAGGGCAGGGACGTAATCAAC-3’）。RT-PCR使用Tks Gflex DNA聚合酶，反应体系为25 μL（含2× buffer 12.5 μL，酶 0.5 μL，上下游引物各 0.25 μM，cDNA 模板 1 μL）。PCR 仪器为 ABI公司 GeneAmp 9700 型，热循环程序为:94°C 预变性1 min;98°C 变性10 s，55°C 退火15 s，68°C 延伸30 s，30 个循环;68°C后延伸5 min。RT-PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳分析，溴化乙锭染色，并在紫外光下拍照。

2 结果与分析

2.1 目的基因的获得

使用简并引物PCR并结合RACE技术成功克隆了二化螟的Cs-cry1和Cs-cry2基因全长序列。序列已提交至Genbank数据库，登录号分别为HG780135和KF977409。Cs-cry1序列中含有1605 bp的开放阅读框（ORF），编码一个由534个氨基酸组成的Cs-CRY1蛋白。该蛋白理论分子量为61.44 kDa，等电点为6.24。Cs-cry2的开放阅读框为2289 bp，编码的Cs-CRY2蛋白含有762个氨基酸，理论分子量与等电点分别为87.28 kDa和8.60。Cs-CRY1的氨基酸序列与棉铃虫（Helicoverpa armigera，一致性88%）、柞蚕（Antheraea pernyi，87%）、家蚕（Bombyx mori，86%）以及帝王斑蝶（D.plexippus，83%） 的CRY1具有很高的一致性;而Cs-CRY2则与棉铃虫（79%）、帝王斑蝶（78%）、家蚕（74%）以及柞蚕（72%）的CRY2较为一致。然而Cs-CRY1与Cs-CRY2之间的一致性却较低，只有42%。在Cs-CRY1和Cs-CRY2的氨基酸序列中均没有预测出信号肽剪切位点和跨膜区。通过比对NCBI的CDD数据库，发现在Cs-CRY1和Cs-CRY2中均有保守的DNA光解酶结构域和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合区域（图 1）［10］。

图1 二化螟Cs-CRY1、Cs-CRY2与其它物种CRY序列连配Fig.1 Alignment of the Chilo suppressalis CRY1，CRY2 with their respective orthologs from other insect species

2.2 系统进化分析

为了深入了解昆虫CRY的亲缘关系，选择了来自不同昆虫的CRY氨基酸序列，使用邻接法构建了进化树（图2）。从图中可见，CRY1与CRY2被划分为2个截然不同的亚家族，而在各个亚家族中，来自同一目昆虫的CRY均聚在同一分支之上。二化螟CRY1和CRY2与鳞翅目昆虫的CRY聚为一支，表示它们在进化中有着更紧密的亲缘关系。CRY的亲缘关系与昆虫进化关系表现出高度一致性。

图2 昆虫CRY的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of the Chilo suppressalis CRY1 and CRY2 with other insect CRYs

2.3 组织表达谱分析

检测了Cs-cry1与Cs-cry2基因在二化螟成虫不同组织中的表达谱（图3），结果表明:Cs-cry1与Cs-cry2基因在各组织中均有表达，但表达量不同。其中Cs-cry1在触角、头部、腹部和足中表达量较高，胸和翅中较低;Cs-cry2基因在腹部表达量最高，头部和胸部次之，触角、翅和足较低。

图3 二化螟成虫不同组织中Cs-cry1和Cs-cry2的表达谱Fig.3 Expression profiles of Cs-cry1 and Cs-cry2 in different tissues of Chilo suppressalis adults.

3 讨论与结论

隐花色素基因cry是昆虫生物钟系统的核心基因之一，在介导昆虫昼夜节律、调控昆虫多种行为过程中起着重要作用［1-3］。目前，对于模式生物cry基因的作用机制已有较为深入的研究［4，6，12］，而对于农业害虫，相关的研究较为有限。水稻害虫二化螟的生物钟基因尚未见报道。本研究克隆获得了二化螟的2个隐花色素基因Cs-cry1和Cs-cry2，为后续的基因功能研究奠定了前期基础。

系统进化分析表明昆虫的cry分化为cry1和cry2两个亚家族，这与前人研究结果一致［4，11，13］。Yuan等［4］分析了昆虫cry基因的进化关系，发现在进化中cry基因至少发生了两轮基因丢失事件，导致昆虫出现了3种不同的cry表达模式:仅有cry1（如果蝇）、仅有cry2（如蜜蜂）及同时具有cry1和cry2（如帝王斑蝶）。不同的cry基因存在模式意味着不同的生物钟调控机制，例如帝王斑蝶的cry1基因编码的CRY1蛋白是光受体，而cry2基因编码的CRY2蛋白却是负反馈回路中的转录抑制因子，这套生物钟机制与果蝇和蜜蜂等完全不同［4，6，12］。本研究发现二化螟同时存在2个cry基因，暗示着二化螟可能具有与帝王斑蝶类似的节律调控机制。

Cs-cry1和Cs-cry2在二化螟成虫各组织中均有表达，这暗示着生物钟不仅存在于二化螟的脑部，还同时存在于其它外周器官之中。Yan等［13］发现棉铃虫cry1和cry2基因在成虫各组织中均可检测到，其中cry1在腹部的表达量最高而触角中表达量最低;cry2在胸部的表达量最高而头部最低。这与本实验结果不同，可能是物种差别所致。此外，Cs-cry1和Cs-cry2在二化螟触角中均有一定量的表达。Merlin等发现海灰翅夜蛾的cry基因表达于触角的嗅觉感器内，并且在24 h周期内，cry基因表达水平的波动与试虫触角电位反应的变化有联系，暗示着cry可能参与了嗅觉节律的调控［8，14］。但是cry对二化螟生物钟具体的调控机制仍不清楚，有待今后继续研究。

综上所述，本研究利用简并引物PCR结合RACE技术，克隆了二化螟隐花色素基因Cs-cry1和Cs-cry2全长序列，分析了这2个基因与其它鳞翅目cry基因的进化关系，并研究了这2个基因在二化螟成虫不同组织内的表达模式，以期为揭示cry在二化螟生物钟分子机制中的作用，以及为利用生物钟调节害虫的节律进而防治害虫提供一定的理论依据。

［1］陈文锋，贺春霞，安春菊，等.昆虫生物钟分子调控研究进展［J］.应用昆虫学报，2011，48（6）:1586-1595.

［2］Tomioka K，Matsumoto A.A comparative view of insect circadian clock systems［J］.Cell Mol Life Sci，2010，67（9）:1397-1406.

［3］Lin C，Todo T.The cryptochromes［J］.Genome Biol，2005，6（5）:220.

［4］Yuan Q，Metterville D，Briscoe A D，et al.Insect cryptochromes:gene duplication and loss define diverse ways to construct insect circadian clocks［J］.Mol Biol Evol，2007，24（4）:948-955.

［5］王文栋，梁辉，朱晓苏，等.家蚕生物钟基因Bmcry1与Bmcry2的克隆及生物信息学分析［J］.昆虫学报，2011，54（1）:9-19.

［6］Zhu H，Yuan Q，Froy O ，et al.The two CRYs of the butterfly［J］.Curr Biol，2005，15（23）:R953.

［7］Ikeno T，Numata H，Goto S G.Photoperiodic response requires mammalian-type cryptochrome in the bean bug Riptortus pedestris［J］.Biochem Bioph Res Co，2011，410（3）:394-397.

［8］Merlin C，François MC，Queguiner I，et al.Evidence for a putative antennal clock in Mamestra brassicae:Molecular cloning and characterization of two clock genes-period and cryptochrome-in antennae［J］.Insect Mol Biol，2006，15（2）:137-145.

［9］盛承发，王红托，高留德.我国水稻螟虫大发生现状、损失估计及防治对策［J］.植物保护，2003，29（1）:37-39.

［10］Czarna A，Berndt A，Singh H R，et al.Structures of Drosophila cryptochrome and mouse cryptochrome1 provide insight into circadian function［J］.Cell，2013，153（6）:1394-1405.

［11］程鹏，徐蓬军，高希武，等.小地老虎隐花色素基因cryptochrome1和cryptochrome2的克隆及mRNA表达分析［J］.应用昆虫学报，2012，49（4）:820-830.

［12］Zhu H，Sauman I，Yuan Q，et al.Cryptochromes define a novel circadian clock mechanism in monarch butterflies that may underlie sun compass navigation［J］.PLoS Biol，2008，6（1）:e4.

［13］Yan S，Ni H，Li H，et al.Molecular cloning，characterization，and mRNA expression of two cryptochrome genes in Helicoverpa armigera（Lepidoptera:Noctuidae）［J］.J Econ Entomol，2013，106（1）:450-462.

［14］Merlin C，Lucas P，Rochat D，et al.An antennal circadian clock and circadian rhythms in peripheral pheromone reception in the moth Spodoptera littoralis［J］.J Biol Rhythm，2007，22（6）:502-514.