万兵 张珊 赵树娟 王国芳

牙周膜成纤维细胞是牙周组织的牙骨质再生、骨组织修复的细胞基础。在牙周组织病变恢复过程中, 牙周组织形成的主要细胞是牙周膜成纤维细胞, 它具有较高的碱性磷酸酶活性和多向分化潜能［1］, 它的活性能够通过碱性磷酸酶活性的高低客观地反映。然而, 在牙周组织病损部位,牙周组织重建及再生达不到很好的效果, 主要是因为数量和来源极为有限。本次采用体外细胞培养法, 研究人牙周膜成纤维细胞活性受牙龈卟啉菌膜泡影响情况, 及银杏叶提取物如何阻断膜泡的生物活性, 为临床治疗牙周病提供了一种实验基础。

1 材料与方法

1.1 ECV提取［2］及细胞培养 将菌种接种于改良模型(GAM)血液琼脂培养基中进行培养, 对培养72 h的细菌培养物, 用超速离心法进行离心, 取上清液(含ECV)备用；取临床上11～15岁因正畸拔除的上颌或下颌双尖牙, 要求牙周牙体组织健康。拔牙前局部消毒。准备预冷细胞培养基(DMEM)培养液, 拔牙后立即放入同时送往实验室。采用胰蛋白酶消化法(按1:3)传代, 选取第5～7代细胞用于实验观察。

1.2 实验方法 利用生长良好第6代细胞, 随机分为空白对照组、膜泡组(50 μg/ml)、银杏叶组(含GBE浓度分别为 0.1、0.01、0.001 mg/ml)+膜泡 (50 μg/ml), 每组设 4个复孔, 并分别加入上述所需药物每孔100 μl, 置培养箱中培养48 h。取出细胞培养板弃去上清液, PBS清洗3次, 每孔加入1 g/LTriton X-100各50 μg, 4℃冷藏过夜, 在显微镜下观察。

2 结果

当50 μg/ml ECV加入细胞培养物中, 人牙周膜成纤维细胞ALP的活性明显抑制, 与对照空白组相比差异有统计学意义(P<0.01)。当加入不同浓度银杏叶提取物时, 人牙周膜成纤维细胞ALP的活性明显增高, 与ECV 组相比差异有统计学意义(P<0.01), 且随ALP的活性随银杏叶提取物浓度的升高而增高, 具有一定的浓度依赖性, 见表1。

表1 ECV抑制人牙周膜成纤维细胞活性受银杏叶提取物的影响(±s, n=4)

表1 ECV抑制人牙周膜成纤维细胞活性受银杏叶提取物的影响(±s, n=4)

注：与空白对照组比较aP<0.05；bP<0.01

药物分组 OD值((n=4, ±s)空白对照组 0.29±0.01膜泡组 0.07±0.01a膜泡+0.001 mg/ml GBE 0.16±0.02b膜泡+0.01 mg/ml GBE 0.19±0.02b膜泡+0.1 mg/ml GBE 0.24±0.01b

3 讨论

牙周炎是常见的慢性感染性口腔疾病, 主要病原菌是Pg。它是游离入周围微环境的一种外膜芽生体［3］, 其胞外膜泡经过细菌外膜向外膨。不仅透过细菌本身不能穿透的解剖屏障, 而且能达到更深的组织导致破坏, 结果使牙齿松动甚至脱落。治疗牙周炎是使病变部位能有一定健康数量的牙周膜细胞(PDLCs)从而建立牙周组织的新附着, 是治疗牙周炎的前提。PDLCs是牙周膜中最主要细胞, 具有大量胶原物质的分泌和合成的功能, 因此有利于病变的牙周组织的再生,有助于牙周组织的修复, 是牙周炎治疗后形成牙龈与牙根面之间新附着的主要细胞来源。

本次试验研究显示: 50 μg/ml ECV加入人牙周膜成纤维细胞培养物中, 它的活性明显受到抑制, 可能通过抑制牙周膜成纤维细胞的活性, 泡膜导致PDLCs数量减少, 进而在牙周组织病变修复过程中, 能够阻止成纤维细胞向成牙骨质细胞或成骨细胞的分化, 阻碍硬组织与骨性修复的钙化, 从而使病变的牙周组织的转归与修复受到影响。当50 μg/ml ECV和3种银杏提取物不同浓度分别同时加入细胞培养物中后, 细胞的ALP活性, 说明在病变修复过程中,银杏提取物可能通过阻断ECV及抑制牙周膜成纤维细胞ALP的活性, 促进牙周膜成纤维细胞转化成骨细胞, 有利于愈合病变。这一结果也为牙周病的治疗提供一定的参考意义。

［1］李德懿.牙周病微生物学新探.国外医学口腔分册, 1986,3(15): 147-151.

［2］倪龙兴, 史俊南, 陈晓玲.成人唾液对牙龈卟啉菌及其提取物毒理学作用的影响.中华微生物学和免疫学杂志, 1997, 17(1):21.

［3］高学敏.中药学.北京: 人民卫生出版社, 1991: 345-239.