吴建军，张延英，张书楠，李金娟，慕婷婷，裴凌云，赵 翊

(甘肃中医学院，甘肃兰州 730000)

酪蛋白 (casein)是牛奶中的主要组成成分，它是一组蛋白的磷酸盐，由4种成分组成:αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白［1］。贞芪酪蛋白肽 (ligustri-astragali casein co-peptid，LACP)是根据“扶正培本、扶正祛邪”的理论，将黄芪、女贞子按一定比例通过水提醇沉法干燥以后再与酪蛋白复合肽按一定比例混合而成［2］。为探讨其对实体瘤生长抑制作用及机制和安全性，进行了本次研究。

1 实验材料

1.1 实验细胞 将Lewis肺癌细胞置于含10%胎牛血清及RPMI-1640培养液中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，2 d更换1次培养液，0.25%胰蛋白酶消化传代。调节细胞密度为5×106个/mL的细胞悬液备用。Lewis肺癌细胞由兰州大学中西医结合研究所提供。

1.2 荷瘤小鼠模型的制作及毒性试验动物 SPF级8周龄C57小鼠72只，雌性，体质量18～22 g，由甘肃中医学院动物实验中心提供 (实验动物合格证号SCXK(甘)2011-0001)。选用培养的Lewis肺癌细胞按106个/mL制成细胞悬液，在各组小鼠右侧腋窝皮下接种0.2 mL悬液。急性毒性试验动物SPF级小鼠由甘肃中医学院实验中心提供，昆明种小鼠100只，雌雄各半，体质量18～22 g，实验前禁食不禁水喂养12 h，室温18～22℃，相对湿度50%～70%。

1.3 药品及试剂 贞芪酪蛋白为以黄芪、女贞子按一定比例按水提醇沉法干燥以后再与酪蛋白复合肽按一定比例混合而成，酪蛋白由兰州同健生物医药公司提供，批号090211。小牛血清购于杭州四季青公司，RPMI-1640培养基干粉为Gibco公司产品，胰蛋白酶由美国Gibco公司产品，Iα抗体购自美国Sigma公司，其他试剂采用国产分析纯。

2 实验方法

2.1 LACP复合物体内抗肿瘤研究的分组及处理 将72只小鼠除随机抽取12只作为阴性对照组之外，其余小鼠Lewis细胞接种后24 h随机分为5组，分别为模型组，贞芪酪蛋白肽复合物1.5、2.1、3.5 g/kg 3个剂量组，阳性药物采用金复康口服液 (江中集团一村制药有限责任公司生产，批号101208);每日2次，连续灌胃给药后第11天麻醉小鼠脱颈处死。生理盐水进行腹腔灌洗，轻柔腹腔2 min后，解剖小鼠抽取灌洗液稀释细胞，单核细胞分离液分离的单核细胞，调整密度至106个/mL，以FITC标记的Iα单抗 (Sigma公司)标记细胞，洗涤后流式细胞仪检测单核细胞Iα分子表达活性 (以阳性细胞数占总细胞数比例表示)。另外，取不同剂量组给药的小鼠右腋窝皮下新鲜肿瘤组织制备单细胞悬液于试管中。静止10 min，吸取上层混浊液。上层混浊液2000 r/min离心5 min，倒去上清。PBS洗涤，制成单细胞悬液，PI染色后流式细胞仪检测细胞周期。

2.2 急性毒性及最大耐受量的测定

2.2.1 LACP复合物LD50测定 取SPF级昆明种小鼠60只，雌雄各半，按随机数字表分为4组 (空白组和不同给药剂量的受试药物组)，每组15只。给药剂量为2.0、1.0和0.5 g/kg。按0.20 mL/10 g分别对各受试药物组小鼠进行灌胃给药，空白组灌胃给予等体积的生理盐水。24 h内给药3次，观察记录小鼠毛色、自主活动、呼吸、饮食、大小便等一般情况、中毒表现及死亡情况，共14 d。

2.2.2 LACP复合物最大耐受量 (MTD)的测定 取SPF级昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分为2组 (空白组和受试药物组)，每组20只。受试药物最大质量浓度200 mg/mL贞芪酪蛋白按0.4 mL/10 g灌胃给药，空白组灌胃给予等体积的生理盐水。

3 实验结果

3.1 LACP复合物对实体瘤细胞周期的影响 贞芪酪蛋白多肽复合物作用肺癌实体瘤细胞，高、中剂量组可见G1期细胞明显增多，分别达到78.1%和64.4%，G2期细胞减少为4.77%和0.439%，S期分别为17.1%和35.1%，提示细胞发生明显的G1/G2期阻滞。见图1。

图1 芪酪蛋白多肽复合物对实体瘤细胞周期的影响

3.2 LACP复合物对免疫细胞Mφ表面Iα抗原表达的影响

贞芪酪蛋白肽复合物能够促进小鼠Mφ细胞系统类Iα抗原表达，显示贞芪酪蛋白肽复合物可以提高小鼠免疫功能，见表1。

表1 贞芪酪蛋白多肽复合物对小鼠Mφ表面Iα抗原表达阳性率的影响 (，n=10)

表1 贞芪酪蛋白多肽复合物对小鼠Mφ表面Iα抗原表达阳性率的影响 (，n=10)

注:与模型组比较，▲P＜005，▲▲P＜001

组别 剂量/(g·kg －1)Iα抗原表达的阳性率/%36.7±4.1模型组 生理盐水 37.2±3.9金福康口服液组 0.1 mL/g 49.9±3.9▲贞芪酪蛋白复合肽低剂量组 1.5 39.1±3.6贞芪酪蛋白复合肽中剂量组 2.1 50.3±4.2▲贞芪酪蛋白复合肽高剂量组 3.5 56.0±4.5阴性对照组 生理盐水▲

3.3 LACP复合物LD50测定结果 给药后连续观察7 d，记录动物死亡、体质量变化和毒性反应情况，结果无一只动物死亡，因受试药物浓度和体积限制，无法测出受试药物的LD50(见表2)，故进行MTD测定。

表2 急性毒性试验结果 (n=15)

3.4 LACP复合物MTD测定结果 给药后连续观察10 d，初步测得MTD值为8 g/kg，记录小鼠中毒症状和死亡情况。观察结果为小鼠活动自如，皮毛整洁、有光泽，鼻、眼、口腔未见异常分泌物，进食、排泄物及呼吸状况等均正常，受试动物无一只死亡。第10天处死全部小鼠，解剖并观察各鼠主要脏器 (心、肝、脾、肺、肾)，未见任何异常改变。小鼠体质量变化观察结果显示，与对照组比较，受试药物组小鼠体质量增加无统计学意义。见表3。

表3 MTD测定在观察期限内体质量的变化 (，n=20)

表3 MTD测定在观察期限内体质量的变化 (，n=20)

注:所有组不同时间与空白组比较，P＞0.05

给药后体质量1 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d 9 d 10 d空白组 0.4mL/10g 19.2±1.919.8±2.118.5±1.720.1±2.221.5±2.623.2±2.623.8±2.524.8±3.125.6±组别 剂量 开始体质量2.7 28.2±3.2受试组 100 mg/mL 19.8±1.720.5±1.919.2±1.921.4±2.122.5±2.623.9±2.624.1±2.725.6±2.928.2±3.2 29.0±3.9

4 讨论

贞芪酪蛋白多肽复合物抑制实体瘤生长作用在前期的研究中已经作了论述，其灌胃给药可有效抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长，其抗肿瘤作用机制可能与改善荷瘤鼠免疫功能等有关［3］。多数蛋白质都存在具有生物活性的多肽序列，酶解蛋白质可以释放生物活性多肽［4］。牛乳中酪蛋白中蕴藏着许多生物活性肽，包括阿片活性肽、抗高血压肽、免疫调节肽、抗血栓肽、结合矿物元素的活性肽、抗菌肽等［5-8］。随着活性肽的研究深入和酶工程技术应用，促进了人们对活性肽物质的兴趣，推进了多肽产品如肽类药物、肽类试剂、化妆品等开发研究［9-12］。目前，日本以及欧美等国家已上市的大量的活性肽功能性食品或食品添加剂，主要用于调节免疫，促进康复，预防疾病发生等。酪蛋白复合多肽同传统中药嫁接将极大地丰富完善各自药理作用，前期课题组的研究进一步证实了上述结论［3，13-15］，本研究根据“扶正培本、祛邪”理论将黄芪、女贞子与酪蛋白按一定比例配制而成并探索了其抗肿瘤作用及机制。非已抗原 (如细菌等)以非特异性方式与巨噬细胞结合，后者借助吞噬、胞饮、吸附或FcR、CR介导的调理作用摄取抗原。巨噬细胞的抗原提呈功能与细胞表面的细胞因子Iα等表达密切相关，所以巨噬细胞表面Iα的表达被认为是代表机体免疫功能的重要标志之一。本研究应用FITC标记的Iα单抗借助流式细胞仪检测显示LACP能提高巨噬细胞表面Iα抗原表达，可能进一步揭示LACP抗肿瘤与调节荷瘤小鼠免疫功能有关。大多数抗肿瘤药物主要作用之一与抑制肿瘤细胞的生长有关，阻滞肿瘤细胞从而促进肿瘤细胞凋亡，本研究显示LACP阻滞肿瘤细胞于G1/G2期。

本实验未测出贞芪酪蛋白多肽复合物的LD50表明贞芪酪蛋白多肽复合物的毒性极低;小鼠灌胃给药的MTD为8g/kg(相当于临床成人拟用药量300倍)，在该剂量下未见小鼠发生任何毒性反应，处死小鼠解剖后观察其主要脏器未见任何异常，显示了LACP复合物的低毒和安全性，为LACP保健品开发利用提供了依据。

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