高丽娟，高 娟，胡耀红，杨 乔

(1.天津西青医院，天津 300380;2.潍坊护理职业学院，山东 潍坊 262500;3.天津医科大学研究生院，天津 300070;4.天津医科大学总医院中医科，天津 300052)

动脉粥样硬化 (atherosclerosis，AS)是众多心脑血管疾病共同的病理基础，也是心血管疾病中最常见的疾病，严重危害人类健康［1-2］。动脉粥样硬化是多病因共同作用的结果，其病理机制复杂。目前认为氧化应激、炎症是动脉粥样硬化发生和发展的核心机制［3-4］。活性氧 (ROS)是动脉粥样硬化炎症反应的始发因素，ROS及其氧化修饰低密度脂蛋白形成的氧化型低密度脂蛋白是内皮损伤和诱导内皮细胞黏附分子、趋化因子、炎性细胞因子表达的主要原因［5］。因此针对动脉粥样硬化抗氧化、抗炎治疗的临床与基础研究成为动脉粥样硬化预防与治疗用药的重要评价手段。水蛭为水蛭科动物蚂蝗的干燥全体，具有破血逐瘀通经的功效。本课题组前期研究表明，水蛭可通过调节脂质代谢、纠正一氧化氮 (NO)代谢紊乱及抑制细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达等环节，干预动脉粥样硬化的形成［6］。高脂血症是AS的独立危险因素之一，可通过诱导局部炎症反应、氧化应激损伤损害血管内皮细胞代谢和功能等诸多作用，导致AS的发生发展［7］。中药多具备“多成分，多靶点”的特点，本实验在前期研究的基础上通过观察水蛭粉对高脂血症大鼠氧化应激及MCP-1表达的影响，进一步探讨其抗动脉粥样硬化形成的机制。

1 实验材料

1.1 动物 健康雄性SD大鼠50只，平均体质量 (220±20)g，购于中国医学科学院放射研究所实验动物中心，许可证号:SCXK(津)2010—0002。

1.2 药物及主要试剂 水蛭粉是由水蛭全体经烘干，研粉炮制而成 (批号20120601)，由贵州信邦制药股份有限公司提供;高脂饲料 (配方:82.7%普通饲料、2%胆固醇、0.3%胆盐、5%蔗糖、10%猪油)和普通饲料由天津实验动物中心饲料厂提供;总超氧化物歧化酶、丙二醛和蛋白定量测试盒均购自南京建成生物工程研究所;单核细胞趋化蛋白-1酶联免疫检测试剂盒购自美国R＆D公司。

1.3 主要仪器 TU-1810紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司)，酶标仪 (北京普天新桥有限公司)等。

2 实验方法

2.1 分组及处理 适应性喂养1周，将大鼠分为5组，空白对照组，模型对照组，水蛭粉高、中、低 (3.0、1.5、0.3 g/kg)剂量组，每组各10只。除空白对照组外，其余各组均喂高脂饲料，用生理盐水将水蛭粉配成不同质量浓度的混悬液，次日按10 mL/kg开始灌胃给药，正常对照组和模型对照组灌服等容积生理盐水，每天1次，连续8周，并于每周称体质量一次以调整给药量。实验满8周，最后一次灌胃后，各组动物禁食 (自由饮水)12 h，次日清晨将全部动物称体质量，股动脉取血，然后处死动物，留取标本。

2.2 计算肝脏指数和脂肪指数 颈椎脱臼处死动物后，剖开腹腔，取出肝脏，迅速称质量，剥离附睾和肾周脂肪，迅速称质量，计算肝脏指数 (肝脏指数=肝质量÷体质量×100%)和脂肪指数 (脂肪指数=脂肪质量÷体质量 ×100%)。

2.3 血清和肝脏的SOD活性和MDA水平测定 股动脉取血，离心取血清备检，另取肝组织，用冷生理盐水漂洗，去除血迹，滤纸拭干，称质量，将血管浸入冷生理盐水(生理盐水质量为血管的9倍)，剪碎，在冰水浴中制成10%的组织匀浆，离心取上清液，按试剂盒说明检测血清和肝组织匀浆的SOD活性和MDA水平。

2.4 主动脉MCP-1表达量测定 取胸主动脉，用冷生理盐水漂洗，去除血迹，滤纸拭干，称质量，将血管浸入冷生理盐水 (生理盐水质量为血管的9倍)，剪碎，在冰水浴中制成10%的组织匀浆，离心取上清液。按试剂盒说明用ELSIA法检测动脉壁MCP-1的表达。

2.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件处理，计量资料均以均数±标准差 ()表示，多组资料组间比较采用单因素方差分析:方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Tamhane’s T2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠血脂的水平 于实验第4周检测各组大鼠血脂的水平，结果显示，模型对照组大鼠血清TC、LDL-C水平均较空白对照组显著升高，HDL-C水平明显降低，差异有统计学意义 (P＜0.01)，模型对照组大鼠血清TG较空白对照组有升高趋势，差异无统计学意义，提示高脂血症大鼠造模成功，见表1。

表1 各组大鼠血脂水平 (，n=10)

表1 各组大鼠血脂水平 (，n=10)

注:与空白对照组比较，☆☆P＜0.01

组别 剂量 /(g·kg －1) TC/(mmol·L －1) TG/(mmol·L －1) LDL-C/(mmol·L －1) HDL-C/(mmol·L －1)1.54±0.16 1.31±0.11 0.46±0.05 1.32±0.25模型对照组 － 3.05±0.94☆☆ 1.23±0.90 0.94±0.34☆☆ 0.96±0.25☆☆水蛭低剂量组 0.3 2.67±0.85 0.91±0.21 0.80±0.23 1.17±0.23水蛭中剂量组 1.5 2.62±0.59 0.96±0.25 0.82±0.20 1.19±0.20水蛭高剂量组空白对照组 －3.0 2.60±0.72 1.02±0.22 0.78±0.25 1.20±0.18

3.2 水蛭粉对高脂血症大鼠体质量的影响 造模初，各组大鼠体质量无差异，随实验进程，各组大鼠体质量逐渐增加，从造模第2周至实验末，模型对照组大鼠体质量明显高于空白对照组 (P＜0.05)。与模型对照组相比，水蛭粉各剂量组大鼠体质量均有不同程度降低，以水蛭粉低剂量组效果最佳，且造模第2周时，水蛭粉低剂量组可显著降低大鼠体质量 (P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠体质量的动态变化 (，n=10，g)

表2 各组大鼠体质量的动态变化 (，n=10，g)

注:与空白对照组比较，☆P＜0.05;与模型对照组比较，*P＜0.05

组别 剂量/(g·kg－1) 0周 2周 4周 6周 8周空白对照组 － 225.9±14.4 290.0±29.5 332.7±40.8 387.4±42.6 403.7±44.0模型对照组 － 238.1±23.2 322.4±41.0☆ 376.9±57.1☆ 430.3±59.7☆ 438.6±51.6☆水蛭粉低剂量组 0.3 226.4±12.4 296.6±17.1* 358.3±22.0 401.5±21.4 411.1±25.1水蛭粉中剂量组 1.5 231.4±21.0 309.6±26.2 377.1±41.5 423.3±49.5 436.3±61.7水蛭粉高剂量组 3.0 228.7±14.0 315.3±22.3 373.2±30.6 420.9±37.0 434.5±42.1

3.3 水蛭粉对高脂血症大鼠肝脏指数和脂肪指数的影响模型对照组大鼠肝脏指数和脂肪指数较空白对照组明显升高 (P＜0.01)，提示模型对照组大鼠体内脂肪沉积增加，且可能有肝组织损伤变化。与模型对照组相比，水蛭粉各剂量组均可显著降低大鼠肝脏指数和脂肪指数 (P＜0.05或P＜0.01)，提示水蛭粉可减少体内脂肪沉积，且可减轻肝组织损伤。水蛭粉各剂量组之间大鼠肝脏指数和脂肪指数无显著差异 (P＞0.05)，见表3。

表3 各组大鼠肝脏指数和脂肪指数的变化(，n=10，%)

表3 各组大鼠肝脏指数和脂肪指数的变化(，n=10，%)

注:与空白对照组比较，☆☆P＜0.01;与模型对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

肝脏指数 脂肪指数空白对照组分组 剂量/(g·kg－1)－ 2.40±0.20 2.65±0.48模型对照组 － 3.79±0.25☆☆ 2.92±0.89☆☆水蛭粉低剂量组 0.3 3.27±0.32＊＊ 3.21±0.38*水蛭粉中剂量组 1.5 3.24±0.40＊＊ 3.00±0.65＊＊水蛭粉高剂量组 3.0 3.13±0.21＊＊ 3.18±0.47*

3.4 水蛭粉对高脂血症大鼠血清SOD活性和MDA水平的影响 与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清SOD活性降低和MDA水平升高 (P＜0.01)，提示体内抗氧化能力下降，氧化应激增高。与模型对照组相比，水蛭粉各剂量组均可不同程度升高大鼠血清SOD活性和降低MDA水平，其中水蛭粉高剂量组可显著升高大鼠血清SOD活性 (P＜0.05)，其中水蛭粉中、高剂量组可显著降低血清MDA水平 (P＜0.01)，提示水蛭粉可改善机体氧化应激状况，以高、中剂量组效果较佳，但无明显量效关系，见表4。

表4 各组大鼠血清SOD活性和MDA水平的变化 (，n=10)

表4 各组大鼠血清SOD活性和MDA水平的变化 (，n=10)

注:与空白对照组比较，☆☆P＜0.01;与模型对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

)分组 剂量/(g·kg－1)SOD/(U·mL －1)MDA/(nmol·mL －1－ 231.86±49.84 16.01±6.33模型对照组 － 171.80±48.32☆☆ 38.25±11.33☆☆水蛭粉低剂量组 0.3 214.63±54.45 23.99±5.42水蛭粉中剂量组 1.5 206.48±37.01 17.34±12.92＊＊水蛭粉高剂量组 3.0 219.79±33.30* 21.88±15.73空白对照组＊＊

3.5 水蛭粉对高脂血症大鼠肝脏SOD活性和MDA水平的影响 与空白对照组相比，模型对照组大鼠肝脏SOD活性降低 (P＜0.01)和MDA水平升高 (P＜0.05)，提示模型对照组肝脏抗氧化能力下降，氧化应激增高。与模型对照组相比，水蛭粉各剂量组均可不同程度升高大鼠肝脏SOD活性和降低MDA水平，其中水蛭粉中剂量组可显著升高大鼠肝脏SOD活性 (P＜0.05)，水蛭粉低、高剂量组可显著降低大鼠肝脏MDA水平 (P＜0.05)，提示水蛭粉可改善肝脏氧化应激状况，无明显量效关系，见表5。

表5 各组大鼠肝脏SOD活性和MDA水平的变化 (，n=10)

表5 各组大鼠肝脏SOD活性和MDA水平的变化 (，n=10)

注:与空白对照组比较，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05;与模型对照组比较，*P＜0.05

分组 剂量/(g·kg－1)SOD/(U·mL －1)MDA/(nmol·mL －1)－ 78.95±8.22 10.94±4.28模型对照组 － 51.77±7.31☆☆ 20.49±11.03☆水蛭粉低剂量组 0.3 58.42±10.41 11.19±7.46*水蛭粉中剂量组 1.5 68.61±19.38* 12.42±6.64水蛭粉高剂量组 3.0 58.58±14.63 9.00±5.11空白对照组*

3.6 水蛭粉对高脂血症大鼠主动脉MCP-1表达的影响 模型对照组大鼠主动脉MCP-1的表达较空白对照组明显增强 (P＜0.05)。与模型对照组相比，水蛭粉各剂量组可不同程度抑制大鼠主动脉MCP-1的表达，其中水蛭粉低剂量组可显著抑制大鼠主动脉MCP-1的表达 (P＜0.01)，见表6。

表6 各组大鼠主动脉中MCP-1蛋白水平的变化 (x ± s，n=10)

4 讨论

血脂异常是动脉粥样硬化形成的首要危险因素，前期研究表明，水蛭粉可通过调节脂质代谢抑制动脉粥样硬化形成。而肥胖与血脂异常的发病率呈正相关，肥胖是指体内脂肪堆积过多和 (或)分布异常、体质量增加，是一种以炎性因子升高为标志的低度炎症状态。过度肥胖造成大量脂肪堆积，脂肪组织分泌脂肪酸增多，通过血液循环入肝，导致极低密度脂蛋白胆固醇 (VLDL)、载脂蛋白B(apoB)、甘油三酯 (TG)升高，而脂肪组织本身就能产生白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性脂肪细胞因子，这些因子可直接或间接地通过促炎、血栓形成、免疫系统慢性激活等方式导致AS形成［8］。适度降低体质量，不仅能减少脂质沉积，改善血脂异常，而且还能抑制炎性脂肪细胞因子的表达，改善动脉粥样硬化病变的炎症反应，对动脉粥样硬化的防治有着积极的意义。实验结果表明，水蛭粉可不同程度降低大鼠体质量，以水蛭粉低剂量组效果最佳，水蛭粉各剂量组均可显著降低大鼠肝脏指数、脂肪指数。提示水蛭粉对内脏肥胖型大鼠有一定减肥作用，可减少体内脂肪沉积，调节脂质代谢，改善机体代谢紊乱，抑制AS的形成。

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，机体或细胞内氧自由基的产生和消除失衡，导致ROS在体内或细胞内蓄积而引起的细胞毒性过程［9］。氧化应激产生的ROS在血管病变，尤其在AS中扮演重要角色［10］。研究表明，高脂血症时，动脉粥样硬化的发生、发展与机体的脂质过氧化所造成的损伤有关，而低密度脂蛋白本身无致动脉粥样硬化作用，氧化修饰是低密度脂蛋白参与动脉粥样硬化形成的先决条件［11］。机体脂质代谢失调会产生大量的氧自由基，具有强烈的引发脂质过氧化作用。MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，其水平间接反映细胞受自由基攻击后的脂质过氧化程度。SOD是生物体内最重要的抗氧化酶，能够清除生物体内的超氧阴离子自由基，是保持自由基动态平衡的超家族蛋白酶，是体内氧自由基的特异性清除剂，其活性的高低反映机体抗氧化能力的强弱。实验结果表明，水蛭粉各剂量组可不同程度改善机体及肝脏氧化应激状况，其中水蛭粉高、中剂量组抗氧化作用优于低剂量组，但无明显量效关系。提示水蛭粉可清除过多氧自由基，阻断由氧自由基介导的脂质过氧化作用对细胞造成的损害，减少脂质过氧化产物的形成，提高机体抗氧化能力，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。

AS是一种慢性炎症反应性疾病［12］。ROS是动脉粥样硬化炎症反应的始发因素，ROS及其氧化修饰低密度脂蛋白形成的氧化型低密度脂蛋白可导致内皮损伤和诱导内皮细胞表达黏附分子、趋化因子、炎性细胞因子。在动脉粥样硬化发生发展过程中，黏附分子和趋化因子对循环中白细胞黏附、迁移及聚集于动脉内膜下起关键作用。ICAM-1是与动脉粥样硬化发生发展密切相关的黏附分子之一，其可促进单核细胞、淋巴细胞向内皮的黏附及迁移，MCP-1是重要的趋化类炎性因子［13］，其可趋化单核细胞和T淋巴细胞，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集，促进循环中白细胞迁移并聚集于动脉内膜，共同参与动脉的炎症过程。前期研究发现水蛭粉可抑制ICAM-1的表达。实验结果表明，水蛭粉可不同程度抑制MCP-1表达，以水蛭粉低剂量组效果最佳。提示水蛭粉可通过抑制黏附分子、趋化因子表达，抑制炎症反应，发挥抗动脉粥样硬化的作用。

综上所述，氧化应激、炎症是动脉粥样硬化发生、发展的核心机制，抗氧化和抑制炎症反应是防治动脉粥样硬化病变的重要措施。本研究表明，水蛭粉可减轻氧化损伤、抑制炎症反应，延缓动脉粥样硬化病变的进展。本研究发现水蛭粉低剂量组减肥、抑制炎症反应的效果优于中、高剂量组，水蛭粉中、高剂量组抗氧化作用优于低剂量组，因样本量和实验时间有限，有关水蛭粉剂量与疗效的关系尚不能确定。而氧化应激产生的大量ROS主要通过氧化修饰及激活信号传导通路参与动脉粥样硬化的形成。对于水蛭粉能否通过阻断ROS激活的信号传导通路干预动脉粥样硬化形成的问题，尚待进一步研究。

［1］Libby P，Ridker P M，Maseri A.Inflammation in atherosclerosis［J］.Circulation，2002，105(9):1135-1143.

［2］徐自超，王淑秀.核转录因子在动脉粥样硬化形成中的作用［J］.新乡医学院学报，2006，23(2):201-204.

［3］Shishehbor M H，Hazen S L.Inflammatory and oxidative markers in atherosclerosis:relationship to outcome［J］.Curr Atheroscler Rep，2004，6(3):243-250.

［4］Minuz P，Fava C，Cominacini L.Oxidative stress，antioxidants and vascular damage［J］.Br J Clin Pharmacol，2006，61(6):774-777.

［5］陈 瑗，周 玫.氧化应激-炎症在动脉粥样硬化发生发展中作用研究的新进展［J］.中国动脉硬化杂志，2008，16(10):757-762.

［6］高丽娟，杨 乔，王 峥，等.脉血康胶囊对高脂血症大鼠脂质代谢及黏附分子表达的影响［J］.中成药，2013，35(1):1-5.

［7］Petnehazy T，Stokes K Y，Russell J M，et al.AngiotensinⅡtype receptor antagonism attenuates the inflammatory and thrombogenic responses to hypercholesterolemia in venules［J］.Hypertension，2005，45:209-215.

［8］孙晓燕，李拥军.肥胖与动脉粥样硬化［J］.临床荟萃，2009，24(16):1470-1472.

［9］Delbosc S，Paizanis E，Magous R，et al.Involvement of oxidative stress and NADPH oxidase activation in the development of cardiovascular complications in a model of insulin resistance，the fructose-fed rat［J］.Atherosclerosis，2005，179(1):43-49.

［10］Antelava N，Pachkoria K Z，Kezeli T D，et al.Major pathogenic links of atheroscler-osis［J］.Georgian Med News，2005，128:72-79.

［11］Stocker R，Keaney J F.Role of oxidative modifications in atherosclerosis［J］.Physiol Rev，2004，84(4):1381-1478.

［12］Paulson K E，Zhu S N，Chen M，et al.Resident intimal dendritic cells accumulate lipid and contribute to the initiation of atherosclerosis［J］.Circ Res，2010，106(2):283-390.

［13］Harrington J R.The role of MCP-1 in atherosclerosis［J］.Stem Cells，2000，18(1):65-66.