张荣秋，董纯明，盛华芳，白秀花，矫立萍，刘金禄，汪卫国，周宏伟，邵宗泽＊

（1.国家海洋局 第三海洋研究所 海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门361005；2.国家海洋局 第三海洋研究所海洋－大气化学与全球变化重点实验室，福建 厦门361005；3.国家海洋局 第三海洋研究所 海洋与海岸地质环境实验室，福建 厦门361005；4.南方医科大学 公共卫生与热带医学学院环境卫生系，广东 广州510515）

1 引言

多 环 芳 烃 （polycyclic aromatic hydrocarbon，PAH）是陆地向海洋中输入的重要持久性污染物之一，由于它对哺乳动物具有致畸、致癌和致突变的特性，美国环保局将其列为优先治理的环境污染物［1—2］。环境中PAHs污染的治理，除使用物理化学的方法外，生物修复的方法越来越受到重视。目前，海洋环境中已经发现多种能够降解PAHs的细菌，如解环菌Cycloclasticus、新鞘氨醇杆菌Novosphingobium、海杆菌Marinobacter、假交替单胞菌Pseudoalteromonas、假单胞菌Pseudomonas和海神单胞菌属Neptunomonas等［3—4］。

由于PAHs化学性质稳定，易在环境中长期残留，所以在“全球蒸馏效应”的作用下，能够从人类活动地区向北极迁移［5—9］。有研究表明，北极地区动物体内、陆地土壤、海洋沉积物中均能检测到PAHs［10—11］。北极地区常年低温，影响了PAHs的生物利用性，同时由于气候环境条件恶劣导致采样困难，所以相比于其他海洋环境，有关北极地区PAHs降解微生物的研究报道较少，且多集中在极地的陆地土壤环境中，优势降解菌以Pseudomonas为主［12—14］。而有关极地海洋表层沉积物中PAHs降解微生物种群的研究，特别是白令海至楚科奇海大尺度范围内，海洋表层沉积物中PAHs降解菌种群结构的研究还未见报道。

本研究以萘、菲、芘为唯一碳源和能源，对采自白令海至楚科奇海8个站位的14个表层沉积物进行了富集，并通过平板分离的可培养手段，及DGGE和Illumina高通量测序的非培养手段分析了降解菌群的结构，并对其中可培养菌株的PAHs降解能力进行了初步的研究。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 样品采集

2010年7—9月，“雪龙”号破冰船在执行中国第四次北极科学考察期间，白令海和楚科奇海8个站位的14份表层沉积物样品被采集。除B07站位样品由多管采泥器采集外，其他样品均由箱式采泥器采集。样品信息见图1和表1。

图1 采样站位

表1 白令海和楚科奇海表层沉积物采样站位

2.1.2 培养基

降解菌群富集用NH培养基配制方法参考文献［4］，但使用原位海水替代实验室陈海水。降解菌分离用的M8培养基参考文献［15］配制。

2.1.3 引物

细菌16S r RNA基因扩增引物，16SF（5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’），16SR （5’－ACGGCTACCTTGTTACGACT －3’）；Box－PCR 引物，BOXA1R （5’－ CTACGGCAAGGCGACGCTGACG－3’）；PCR－DGGE引物，V3F （5’－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGG GGGGCCTACGGGAGGCAGCAG－3’）；V3R （5’－ATTACCGCGGCTGCTGG－3’）；细菌16Sr RNA V6区Illumina高通量测序Barcode引物967F（5’－NNNNNNNNGTCNACGCGAAGAACCTTANC－3’），1046R（5’－GCATTCGACAGCCATGCANCACCT－3’）。

2.1.4 主要试剂及仪器

萘（纯度大于99.8%）购自国药集团化学试剂有限公司；菲和芘（纯度大于97%）购自Sigma－Aldrich公司；PCR相关试剂购自Fer mentas公司；恒温摇床和超净工作台（上海智诚分析仪器制造有限公司）；生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；AlphaInnotech凝胶成像仪（SanLeandro，California）；PCR扩增仪（Bio－Rad）；Decode System 电泳仪（Bio－Rad公司）；p GEMⓇ －T Easy Vector Systems（Promega）。

2.2 沉积物中PAHs含量分析

沉积物中PAHs的抽提、纯化、GC－MS定量分析方法参考文献［15］，其中美国环保局推荐优先治理的16种PAHs被定量分析，定量方法采用内标法。

2.3 PAH降解菌的富集和分离鉴定

14份沉积物样品在船上采集后，分别取5 g接种于250 mL NH富集培养基中，并补加1 mL内含PAHs的原油（萘、菲、芘在培养基中终浓度分别为：200、100和50 mg／L），于4℃静置避光培养（约2～3个月）。回实验室后，取10 mL富集物转接到100 mL新鲜的NH培养基中，并补加PAHs混合物（终浓度同上），25℃，150 r／min避光培养4周。随后，富集物梯度稀释涂布M2培养基平板，25℃避光培养2周后，挑取不同形态的单菌落，在M2平板上划线纯化两次后保藏菌种，同时收集部分菌体用于基因组DNA的抽提。

2.4 细菌DNA提取和系统进化分析

菌株及菌群基因组DNA的提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。同一站位分离的菌株利用BOX－PCR（94℃，4 min；94℃，15 s，53℃，30 s，65℃，8 min，共35个循环；65℃，25 min）剔除重复菌株。剩余菌株的16Sr RNA基因被扩增、测序并提交NCBI Blast N 和 EzBio Cloud网站（http：／／eztaxon－e.ezbiocloud.net／）进行系统发育分析；最后用 MEGA（version 4.0）软件构建系统进化树（Neighbor－Joining算法）。

2.5 富集菌群结构的PCR－DGGE和Illumina高通量测序分析

富集菌群16S r RNA基因V3区扩增、纯化和DGGE电泳分析，亮带切胶回收，测序过程参考文献［15］。同时，我们利用细菌16S r RNA基因V6区barcode引物扩增各个富集菌群的16Sr RNA基因V6区，PCR产物纯化后等摩尔比混合后，提交Illumina HiSeq2000测序平台进行Pair－end（100 bp）测序分析。测序后高通量数据分析采用BIPES流程，read的聚类采用TSC算法［16－17］，并以97%的序列相似性作为OTU划分的标准，read系统发育地位的确定采用GAST（Global Alignment for Sequence Taxonomy）方法［18－19］。菌群聚类分析采用 PRI MER （v6.1.5）软件；CA分析使用Canoco（V4.5）软件。

2.6 可培养菌株PAH降解能力验证

从平板上刮取新鲜的菌株培养物，接种于50 mL内含PAHs混合物的NH培养基中，25℃，150 r／min培养3周，通过测定细胞浓度（OD600），及观察比较培养物颜色变化情况来判断菌株是否利用PAHs。

3 结果

3.1 沉积物中PAHs定量分析

GC－MS定量结果表明，14个表层沉积物中PAHs总干质量介于32.99～276.97 ng／g（见表1），海盆区（白令海）表层沉积物中PAHs含量高于陆架区（白令海和楚科奇海），所有样品中3环及3环以下PAHs的量占PAHs总量的90%以上。菲和芴分别是每个样品中含量最高的两种PAHs。

3.2 可培养菌株的分离鉴定与系统进化分析

4℃富集菌群转接到25℃培养4周后，14个富集菌群中分离获得51株细菌。系统进化分析表明它们分属于γ－proteobacteria，α－proteobacteria，Actinobacteria，Fir micutes和Bacteroidetes门中的17个属（见图2）。其中γ－proteobacteria门是优势类群，占可培养菌株总数的58.82%，它们多归属于Marinobacter、Halomonas、Pseudoalteromonas和Pseudomonas属；Actinobacteria门占19.61%，主要种属是Dietzia、Salinibacterium和Isoptericol a；归属于α－proteobacteria、Bacteroidetes和Fir micutes门菌株的比例较小，分别是7.84%、7.84%和5.88%。总体上而言，Marinobacter是25℃富集菌群中优势属，占可培养菌株总数的29.41%。

图2 富集菌群中可培养菌株的16Sr RNA基因系统发育树

3.3 菌株PAH降解能力验证

将富集菌群中可培养菌株接种于补加PAHs的NH培养基中，3周后观察其生长情况（见表2）。菌株以3种PAHs为碳源和能源生长的情况表明，共有7株菌可单独利用PAHs生长，其中2株迪茨氏菌（Dietzia）都具有很好的降解效果。

表2 可培养菌株对PAHs降解能力的验证

3.4 菌群组成的PCR－DGGE分析

为了分析PAHs降解菌群的种群组成，我们以25℃富集菌群的总DNA为模板，利用细菌16Sr RNA基因V3区引物进行扩增，获得长约200 bp的扩增产物，随后进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析（图3）。通过对菌群中亮带的切胶回收、克隆测序和比对分析，鉴定亮带所对应的菌株，从而解析菌群中的优势菌株。

图3 PAHs降解菌群组成的DGGE分析

DGGE结果表明，14个菌群中除R06d和B07u等2个菌群结构较为简单外，其余12个菌群中亮带均较多，这说明PAHs降解菌群中细菌种群多样性较高（图3）。14个菌群中所有切胶测序的79个亮带对应的最近缘菌株共来自26个细菌属，包括γ变形菌门的Marinobacter，Pseudoalteromonas，Pseudomonas，Halomonas，Thal assolituus，Oceanisphaer a，Coclei monas，Rhodanobacter，Methylophaga，Alcanivor ax和Marinomonas；α变形菌门的Sinor hizobium，Roseovarius，Sul f itobacter，Sphingosinicella，Methylobacterium；β变形菌门的Achromobacter；CFB类群的Maribacter，Bacillus，Salegentibacter，Muricauda和Sedi minicol a；以 及 Actinobacteria门 的Dietzia，Nocar dioides，Salinibacterium和Saccharothrix。上述种属中有12个获得了纯培养菌株，这包括γ变形菌门的Marinobacter，Halomonas，Pseudoalteromonas，Pseudomonas，Alcanivorax和Oceanisphaer a；α变形菌门的Sul f itobacter；CFB 类 群 的Bacill us，Maribacter和Muricauda，以及Actinobacteria门的Salinibacterium和Dietzia。

3.5 菌群结构的Illumina高通量测序分析

为了进一步分析14个降解菌群的种群结构，我们利用Illu mina HiSeq2000测序平台，采用Pair－end 100 bp测序策略，对菌群中细菌16S V6高变区进行了高通量测序。14个菌群共获得172 410条reads，去除低质量reads及嵌合体（Chi mera）后，共获得149 838条Clean reads（约61 bp），平均每个菌群获得10 700条Clean reads，随后这些Clean reads被用于种群结构分析。聚类分析结果表明，这些Clean reads归属于15 455个Unique，5 585个OTU（见表3）。多样性指数结果表明，来自白令海盆及陆架富集菌群的多样性指数较高，如B04站位；而来自楚科奇海的较低，如R06站位。

表3 富集菌群Illumina高通量测序结果及多样性评估

3.5.1 稀释度曲线

稀释度曲线显示，所有菌群中检测到的OTU（97%序列相似度）数目介于200～600个（图4）；同时，所有菌群的覆盖率介于72%～87.1%，这些结果说明14个PAHs富集菌群中细菌多样性丰富。相比较而言，B04u和B04d两个菌群中微生物多样性最丰富，其稀释度曲线还未趋于饱和。

图4 PAHs降解菌群的稀释度曲线

3.5.2 种群结构聚类分析

14个菌群的聚类和CA分析均表明，所有14个富集菌群可以分为2个类群：陆架类群（Bering and Chukchi Shelves）和海盆类群（Bering Basin）。陆架类群中包括9个来自水深较浅的白令海和楚科奇海陆架；而海盆类群的5个菌群均来自水深较深的白令海海盆（图5A）。CA分析结果表明，除B07u菌群外，陆架和海盆两个类群能够很好地被PC2轴区分（variable value＝23.8%），特别是9个来自陆架区的菌群在CA结果中高度集中（图5B），这表明这9个菌群的结构存在较高的相似性。相反，4个来自海盆区的菌群在CA结果中分布的较分散。

图5 PAHs降解菌群结构的聚类分析

3.5.3 种群结构分析

在所有14个测序菌群的149 838条Reads中，属于Proteobacteria门的reads占绝对优势（75.5%），而分列第二位和第三位Actinobacteria和Fir micutes门的比例仅为12.5%和9.5%。除B02u、B04u、B07d和NB02d站位外，γ变形菌群的细菌是各个富集菌群中的优势类群，特别是在陆架区的降解菌群中，比例更是高达66.4%。

14个菌群共检测到232个属，丰度最高的10个属依次是：Pseudomonas，Marinobacter，Halomonas，Bacillus，Pseudoalteromonas，Sul f itobacter，Shewanell a，Leif sonia，Dietzia和Roseovarius（见图6）。但具体到每个菌群，种属组成变化较大，例如已报道的PAHs降解菌Pseudomonas主要集中在陆架区的NB02u、CC1u、CC1d和 R09u站位；Marinobacter主要在集中在陆架区的BB05u、R06u、R06d和R09d站位；Pseudoalteromonas则主要集中在陆架区的BB05u、CC1u、CC1d和R09u站位；Dietzia则主要集中在陆架区的B07d站位；Halomonas多分布在B07u、NB02u和R09d站位。此外，我们也发现了海洋专属的PAHs降解菌Cycloclasticus，它多分布在陆架区的富集菌群中（0.01%～7.74%），特别是在BB05u站位中比例高达7.7%。

图6 富集菌群在属水平上相对丰富分析

4 讨论

北极地区相对于其他环境，受人类活动影响较小，虽然环境受污染程度较轻，但是持久性有机污染物能够通过“全球蒸馏效应”在极地冷却沉降，本研究也从白令海至楚科奇海表层沉积物中检测到多种PAHs，这为PAHs降解菌的存在提供了物质基础。但是，相比于近海环境，本研究中14个表层沉积物中16种PAHs总量远低于近岸环境［20—22］。

平板纯培养、PCR－DGGE和Illumina高通量测序结果都表明，14个菌群中优势的降解菌主要是γ变形菌门的Marinobacter，Pseudoalteromonas，Pseudomonas和Actinobacteria门的Dietzia菌；然而，多数近海和大洋环境中优势的PAHs降解菌多是Cyclocl asticus，Novosphingobium和Pseudomonas［4，15，23—25］。前期对北极地区土壤中PAHs降解菌群的研究发现，Pseudomonas往往是菌群中的优势菌［12—14］，所以推测本研究中PAHs降解菌群中的Pseudomonas可能是随陆源河水输入到白令海和楚科奇海中。Pseudoalteromonas菌代谢功能多样，是极地等低温环境中常见的可培养类群，也经常被发现于极地来源的石油及PAHs降解菌群中［26—29］，所以其在本研究的降解菌群中是优势种属符合前期研究结果。Marinobacter菌是海洋环境中专属的烃类降解菌［30］，前期已有报道证实在北极石油污染的海冰中Marinobacter是其中重要的类群［31］，同时近期也有研究表明它可以降解PAHs［32］，所以我们的结果暗示了它和Pseudomonas菌可能是北极低温环境中重要的PAHs降解菌。此外，放线菌门的Dietzia菌虽然不是降解菌群中优势的种属，但单菌降解实验结果表明，它们对PAHs具有一定的降解效果（表2）。

在进行降解菌群结构分析时，虽然PCR－DGGE是经典的方法，但是它只能检测到菌群中丰度大于1%的类群［33］。而Illumina测序技术能够提供更高的测序通量和深度，能够发现菌群中丰度更低（＜0.01%）的种属。如本研究中用纯培养和PCRDGGE技术分别获得了17和26个细菌属，而通过Illumina高通量测序技术，共检测到232个细菌属，这其中包括多种纯培养及PCR－DGGE技术未检测到的PAHs降解菌，如：Cycloclasticus，Sphingopyxis，Alteromonas，Neptunomonas和Sphingomonas等。以上结果暗示了，多种类型的PAHs降解菌存在于北极表层沉积物中，但仅有少量能够长期适应北极特殊环境的PAHs降解菌成为降解菌群中的优势类群。

5 结论

白令海及楚科奇海表层沉积物中PAHs总干质量介于32.99～276.97 ng／g，且呈现由深海海盆向陆架降低的趋势。纯培养、PCR－DGGE及Illu mina高通量测序结果均表明，该区域中优势的PAHs降解菌是Marinobacter，Pseudoalteromonas，Pseudomonas和Dietzia。此外，Illumina高通量测序结果还表明14个降解菌群在结构组成上，可分为海盆区和陆架区两种类群；同时降解菌群中也存在一些低丰度的海洋专属PAHs降解菌，如Cycloclasticus，Alteromonas和Neptunomonas等。

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