邵发保+++徐祝丽+++黄勤兰

[摘要] 目的 检测miR-26a在胃癌组织的表达改变，明确miR-26a调控胃癌细胞生长的分子机制。方法 运用qRT-PCR检测71例胃癌及相应癌旁正常组织中miR-26a的表达改变；将miR-26a 模拟物转染胃癌细胞AGS，采用Western blot检测其对MTDH蛋白表达水平的影响；然后采用MTT法检测高表达miR-26a对AGS细胞生长增殖的影响。结果 qRT-PCR检测结果显示，miR-26a在71例胃癌组织中表达下调0.44倍；Western blot结果显示，过表达miR-26a或干扰MTDH可抑制MTDH蛋白的表达。MTT检测发现，转染MTDH siRNA和miR-26a 模拟物组AGS细胞从48 h起OD值分别为（0.158±0.006）、（0.201±0.006），与对照组细胞相比（0.515±0.032）、（0.479±0.028），差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 miR-26a通过靶向调控MTDH的表达而抑制胃癌细胞的生长。

[关键词] miR-26a；胃癌；生长增殖

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）26-0011-03

miRNAs 调控重要的生物学过程，包括发育、细胞增殖和凋亡、细胞分化、代谢等，并且在很多疾病中表达失调，包括肿瘤[1，2]。根据生物软件的预测，每个miRNA可能调控上百个靶基因，大约调控人类1/3蛋白编码基因的表达。目前，对miRNA的研究正逐步从基本的肿瘤分子研究走向临床应用领域。miRNAs可作为一个潜在的生物标志物用于胃癌的诊断、预后、药物反应以及易感性的预测等方面的潜能。研究表明，miR-26a在肝癌、鼻咽癌、胃癌以及乳腺癌组织和细胞中表达下调，且抑制肿瘤细胞的生长增殖[3-5]。但miR-26a在胃癌中的具体生物学功能并不清楚。本研究拟通过采用qRT-PCR、Western blot以及MTT法检测miR-26a在胃癌中的生物学作用及作用机制。

1 资料与方法

1.1临床资料

收集2008年1月～2013年7月间我院收治且确诊为胃癌的患者71例。中位年龄53（39～70）岁。病理诊断结果均经两名以上病理科医生确认。

1.2主要材料

miR-26a 模拟物及对照模拟物从Ambion公司购买。MTDH siRNA质粒从santa cruz公司购买。MTDH抗体和β-actin抗体购自santa cruz公司。Trizol和Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。PRIM1640培养基和胎牛血清为Gibco公司产品。MTS细胞生长增殖/毒性检测试剂盒购自美国Sigma公司。

1.3 Western blot

将miR-26a模拟物或MTDH siRNA质粒转染AGS细胞，48 h后提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。各组取等量样本，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上，5%BSA封闭，加入MTDH或GAPDH抗体，4℃过夜。TBST洗膜30 min，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜30 min，加入ECL发光剂，X片曝光、显影、定影。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性

取转染后的AGS细胞，消化后接种细胞于96孔板中，每空5000个细胞，每组设6个复孔，置37℃、5% CO2培养箱中培养。在未接种细胞的孔中加入RPMI-1640培养基中作为调零孔。接种72 h后，每孔加20 μL MTS检测试剂，37℃孵育2 h，用酶标仪测定492 nm波长吸光度值（OD492）。实验重复3次。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。所有结果均以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌及其相应癌旁组织中miR-26a表达水平分析

qRT-PCR结果显示，miR-26a在71例胃癌组织中的表达为（0.49±0.11），在71例胃癌癌旁正常组织中表达为（1.12±0.20），两者相比下调0.44倍，差异具有统计学意义（P =0.008）。

2.2 miR-26a对胃癌AGS细胞中MTDH蛋白表达的影响

研究已表明MTDH是miR-26a的靶基因，为了明确miR-26a对胃癌AGS细胞MTDH的蛋白质表达的调控作用，将miR-26a 模拟物转染胃癌AGS细胞，以转染miR-26a-对照为阴性对照，转染MTDH siRNA为阳性对照，转染48 h后收集蛋白。Western blot检测结果显示，转染miR-26a模拟物组和MTDH siRNA组MTDH蛋白表达水平较阴性对照组明显降低（图1）。结果提示，miR-26a能下调胃癌AGS细胞系中MTDH蛋白质的表达。

2.3 miR-26a对胃癌细胞增殖能力的影响

分别将miR-26a-模拟物，miR-26a-对照（阴性对照组）和MTDH siRNA以及siRNA-对照（阴性对照组）转入AGS细胞24、48、72 h后，通过MTT法检测其对细胞增殖活性的影响。结果显示，转染MTDH siRNA和miR-26a 模拟物组AGS细胞从48 h起OD值分别为（0.158±0.006）、（0.201±0.006），其增殖速度明显减慢，与miR-26a 对照组细胞相比（0.515±0.032）、（0.479±0.028），差异均有统计学意义（P<0.05），提示高表达miR-26a通过下调MTDH的表达，从而抑制胃癌AGS细胞的生长增殖。

3讨论

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居第四位，死亡率居第二位[6]。其中，大约60%的胃癌患者发生在东亚（主要在中国）。在中国，大约2/3的胃癌患者发展成为晚期或转移性癌症，超过一半的患者在根治性手术后复发，而这些患者的生存期一般为6～9个月[7]。随着生活水平的提高、内窥镜的应用以及多模式的治疗方案的实施，近几十年来胃癌的发病率和死亡率有所下降，但是晚期胃癌的死亡率仍然居高不下。鉴于目前的状况，有效地早期生物标志物的鉴定以及高效低毒药物的开发成为当务之急。

胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段的病理过程，涉及很多相关癌基因和抑癌基因的变化。尽管目前在遗传学和分子生物学等方面进行了广泛的研究，但是目前对于胃癌的发生发展机制仍然知之甚少。这可能是由于胃癌是一种遗传异质性疾病，通过不同的途径所致。miRNA表达谱研究表明，其在不同类型的肿瘤中表达水平各异。研究证实，异常的miRNA基因往往位于癌症相关的基因突变位点，说明miRNA参与癌症的发生发展。研究表明，不同的miRNA参与胃癌发展过程中的不同组织学类型和疾病发展的不同阶段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在弥漫型胃癌中表达上调，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在肠型胃癌中表达上调[8]。在未分化的胃癌组织中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明显上调， 而miR-128b、miR-129、miR-148却表达下调。目前有关miR-26a在肿瘤中作用的研究报道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下调，其表达水平与肝癌患者生存时间及对干扰素治疗的敏感性相关[3]。miR-26a在鼻咽癌中表达下调且能通过靶基因EZH2抑制鼻咽癌细胞生长和致瘤性[4]。同时miR-26a能明显抑制乳腺癌细胞增殖生长，诱导乳腺癌细胞凋亡[9]。进一步研究发现miR-26a可通过靶向MTDH抑制乳腺癌细胞的生长增殖[10]。MTDH最初是在胎儿胶质细胞瘤中发现，是一个HIV诱导的基因，并且作为癌基因参与多种肿瘤的发生发展。研究证实MTDH在多种恶性肿瘤中表达上调，并且通过PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信号途径参与肿瘤发生的多种生物学过程[11]。

综上所述，miR-26a在胃癌细胞中表达下调，并通过直接靶向调控MTDH的表达发挥生物学作用，我们将继续深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系统阐明miR-26a参与胃癌发生发展的可能分子机制，为胃癌的治疗提供新的治疗靶点。

[参考文献]

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[2] Tang H，Kong Y，Guo J，et al. Diallyl disulfide suppresses proliferation and induces apoptosis in human gastric cancer through Wnt-1 signaling pathway by up-regulation of miR-200b and miR-22[J]. Cancer Letters，2013，340（5）：72-81.

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[9] Gao J，Li L，Wu M，et al. miR-26a Inhibits proliferation and migration of breast cancer through repression of MCL-1[J]. PLoS One，2013，8（12）：e651

[10] Zhang B，Liu XX，He JR，et al. Pathologically decreased miR-26a antagonizes apoptosis and facilitates carcinogenesis by targeting MTDH and EZH2 in breast cancer[J]. Carcinogenesis，2011，32（1）：2-9.

[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）

胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段的病理过程，涉及很多相关癌基因和抑癌基因的变化。尽管目前在遗传学和分子生物学等方面进行了广泛的研究，但是目前对于胃癌的发生发展机制仍然知之甚少。这可能是由于胃癌是一种遗传异质性疾病，通过不同的途径所致。miRNA表达谱研究表明，其在不同类型的肿瘤中表达水平各异。研究证实，异常的miRNA基因往往位于癌症相关的基因突变位点，说明miRNA参与癌症的发生发展。研究表明，不同的miRNA参与胃癌发展过程中的不同组织学类型和疾病发展的不同阶段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在弥漫型胃癌中表达上调，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在肠型胃癌中表达上调[8]。在未分化的胃癌组织中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明显上调， 而miR-128b、miR-129、miR-148却表达下调。目前有关miR-26a在肿瘤中作用的研究报道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下调，其表达水平与肝癌患者生存时间及对干扰素治疗的敏感性相关[3]。miR-26a在鼻咽癌中表达下调且能通过靶基因EZH2抑制鼻咽癌细胞生长和致瘤性[4]。同时miR-26a能明显抑制乳腺癌细胞增殖生长，诱导乳腺癌细胞凋亡[9]。进一步研究发现miR-26a可通过靶向MTDH抑制乳腺癌细胞的生长增殖[10]。MTDH最初是在胎儿胶质细胞瘤中发现，是一个HIV诱导的基因，并且作为癌基因参与多种肿瘤的发生发展。研究证实MTDH在多种恶性肿瘤中表达上调，并且通过PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信号途径参与肿瘤发生的多种生物学过程[11]。

综上所述，miR-26a在胃癌细胞中表达下调，并通过直接靶向调控MTDH的表达发挥生物学作用，我们将继续深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系统阐明miR-26a参与胃癌发生发展的可能分子机制，为胃癌的治疗提供新的治疗靶点。

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[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）

胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段的病理过程，涉及很多相关癌基因和抑癌基因的变化。尽管目前在遗传学和分子生物学等方面进行了广泛的研究，但是目前对于胃癌的发生发展机制仍然知之甚少。这可能是由于胃癌是一种遗传异质性疾病，通过不同的途径所致。miRNA表达谱研究表明，其在不同类型的肿瘤中表达水平各异。研究证实，异常的miRNA基因往往位于癌症相关的基因突变位点，说明miRNA参与癌症的发生发展。研究表明，不同的miRNA参与胃癌发展过程中的不同组织学类型和疾病发展的不同阶段，如miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-99a、miR-143、miR-145、miR-133a 在弥漫型胃癌中表达上调，而miR-373*， miR-498， miR-202*， miR-494 在肠型胃癌中表达上调[8]。在未分化的胃癌组织中， miR-34b、miR-34c、miR-128a 明显上调， 而miR-128b、miR-129、miR-148却表达下调。目前有关miR-26a在肿瘤中作用的研究报道很少。研究表明miR-26a在肝癌中下调，其表达水平与肝癌患者生存时间及对干扰素治疗的敏感性相关[3]。miR-26a在鼻咽癌中表达下调且能通过靶基因EZH2抑制鼻咽癌细胞生长和致瘤性[4]。同时miR-26a能明显抑制乳腺癌细胞增殖生长，诱导乳腺癌细胞凋亡[9]。进一步研究发现miR-26a可通过靶向MTDH抑制乳腺癌细胞的生长增殖[10]。MTDH最初是在胎儿胶质细胞瘤中发现，是一个HIV诱导的基因，并且作为癌基因参与多种肿瘤的发生发展。研究证实MTDH在多种恶性肿瘤中表达上调，并且通过PI3K-AKT、NF-κB、MAPK以及Wnt/β-catenin信号途径参与肿瘤发生的多种生物学过程[11]。

综上所述，miR-26a在胃癌细胞中表达下调，并通过直接靶向调控MTDH的表达发挥生物学作用，我们将继续深入miR-26a在胃癌中的功能和分子研究，系统阐明miR-26a参与胃癌发生发展的可能分子机制，为胃癌的治疗提供新的治疗靶点。

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[11] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM. Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J]. J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

（收稿日期：2014-04-24）