薛城敬+++苏言辉+++王亚洲+等

[摘要] 目的 建立2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠模型，观察桑叶黄酮对大鼠肝组织PPARγ的影响，探讨桑叶黄酮改善胰岛素敏感性及脂肪肝发病的可能分子机制。 方法 用小剂量链脲佐菌素（STZ）注射加高脂饲料喂养，建立2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠模型；分别给予桑叶黄酮和罗格列酮喂食，测空腹血糖、胰岛素、PPARγ，观察大鼠肝组织PPARγ的变化。结果 ①模型对照组（MOD组）大鼠胰岛素敏感指数相对正常对照组（NOR组）显著降低，但桑叶黄酮组（MLF组）、罗格列酮组（RGZ组）比MOD组胰岛素敏感指数显著升高，而MLF组和RGZ组差异无显著性。②与NOR组相比，MOD组大鼠肝组织PPARγ表达显著减少；MLF组、RGZ组与MOD组相比，肝组织中PPARγ表达显著增加；MLF组与RGZ组相比，肝组织中的PPARγ表达差异无显著性。结论 桑叶黄酮能提高2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗，其胰岛素增敏作用可能与提高肝组织中的PPARγ表达有关。

[关键词] 桑叶黄酮；2型糖尿病；脂肪肝；PPARγ；胰岛素抵抗

[中图分类号] R2-031；R587 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）26-0001-04

2型糖尿病的发病基础是胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），而脂肪细胞因子分泌异常是IR的一个重要机制[1-3]，影响着胰岛素信号转导通路。过氧化物酶体增殖体激活受体（PPARs）是脂肪细胞因子的调控子之一。桑叶黄酮可改善高脂喂养2型糖尿病大鼠IR，降低氧化应激水平[4-6]。这些作用可能与PPARγ有关。本研究主要观察桑叶黄酮对2型糖尿病并发单纯性脂肪肝大鼠肝组织PPARγ的影响，以进一步了解桑叶黄酮改善胰岛素敏感性的作用机制，为桑叶黄酮治疗糖尿病的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与药品 大鼠胰岛素ELISA试剂盒，PPARγ免疫组化试剂盒，PPARγ ELISA试剂盒。STZ溶液（用前以0.1mol/L、pH4.2的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制成0.5%溶液），枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，市售罗格列酮、桑叶提取物（提取纯化桑叶黄酮含量为5.4%）。

1.1.2 实验动物与饲料 标准清洁级雄性SD大鼠50只，体重130～160 g， 6～8周龄。普通饲料由我院动物房提供；高脂饲料喂养前一周临时配制，4℃保存，总热量为18.7 KJ/g，其中碳水化合物30.04%、脂肪55.37%、蛋白质14.59%。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立、动物分组及给药 雄性SD大鼠50只，参考胡爱民等[7]的方法造模。先在动物房适应性喂养1周。从第2周开始，随机取大鼠10只为正常对照组（NOR组），予以普通饮食，自由饮水，延续7周，于实验第9周，按体重5 mL/kg于腹腔内注射枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。其余40只大鼠予以高脂饮食，自由饮水，延续7周，于第9周按体重25 mg/kg于腹腔内注射0.5%STZ 1次。9周末检测大鼠空腹血糖（FBG）和胰岛素（Fins），以空腹血糖≥7.0 mmol/L，伴有IR即胰岛素敏感性降低为2型糖尿病成模标准。成功造模36只，随机抽取6只以0.1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.1 mL/100g）后取肝组织，观察大鼠肝组织病理变化情况。剩余30只大鼠随机分为模型对照组（MOD组）10只、桑叶黄酮组（MLF组）10只、罗格列酮组（RGZ组）10只。NOR组、MOD组于实验第10周开始每天用4 mL/kg生理盐水灌胃；MLF组于实验第10周开始每天用桑叶黄酮（8 g/kg）灌胃；RGZ组于实验第10周用罗格列酮（2 mg/kg）灌胃。干预8周后，禁食12 h测FBG和Fins，并常规制备血清于-20℃冰箱保存以待测相关指标。0.1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.1 mL/100 g）后取肝组织于4%多聚甲醛固定，24 h内制成石蜡块保存。

1.2.2 血糖、胰岛素测定 血糖用葡萄糖氧化酶法测定，胰岛素用大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。胰岛素敏感指数（ISI）= Fins与FBG乘积倒数的自然对数。

1.2.3 PPARγ检测 血清PPARγ用ELISA法检测，按试剂盒说明书进行操作。免疫组化与图像半定量分析检测肝组织PPARγ的表达。以阳性细胞所占百分率进行分级：<10%为-，10%～30%为+，30%～70%为++，70%以上为+++。

1.3 统计学处理

采用SPSS 12.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，采用配对t检验、方差分析和LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物干预8周后各组FBG、Fins、ISI比较

MOD组与NOR组相比，上述各项指标均有显著差异（P<0.01）；与MOD组相比，治疗组血糖值均有下降，差异有统计学意义（P<0.01），其中罗格列酮降血糖作用最为明显；MLF组与RGZ组相比较，差异无统计学差异（P>0.05）；MOD组大鼠胰岛素敏感指数相对NOR组显著降低（P<0.01），MLF组和RGZ组比MOD组胰岛素敏感指数显著升高（P<0.01），而MLF组和RGZ组差异无显著性（P>0.05）。

2.2 大鼠肝脏病理标本情况

结果显示，6只高脂饮食大鼠镜下肝组织均有明显脂肪变，胞浆内有大小不等的脂肪空泡。

2.3 各组血清PPARγ的比较

与NOR组（407.6±74.67）pg/mL比较，MOD组血清PPARγ[（119.8±21.71）pg/mL]明显降低，差异显著（P<0.01）。MLF组（252.2±68.50）pg/mL、RGZ组（305.1±65.47）pg/mL与MOD组相比均有显著差异（P<0.01）；RGZ组PPARγ高于MLF组，但差异无统计学意义。

2.4 各组PPARγ免疫组化图像和结果比较

2.4.1 免疫组化染色结果。

2.4.2各组PPARγ免疫组化结果比较 与NOR组相比，MOD大鼠肝组织中的PPARγ显著减少；MLF组和RGZ组与MOD组相比，肝组织中的PPARγ显著增加；MLF组与RGZ组相比，肝组织中的PPARγ差异无显著性。

3 讨论

糖尿病和脂肪肝是危害人类健康的常见慢性病，两者关系密切。糖尿病可以引起肝脏损伤，其中主要是非酒精性脂肪肝（多为单纯性脂肪肝）。非酒精性脂肪肝病是遗传-环境-代谢应激相关因素所致的以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。主要病因有肥胖、2型糖尿病和血脂紊乱等，并常与这些代谢性疾病伴发出现。关于非酒精性脂肪肝的发病机制[8，9]，得到最广泛认可的是“二次打击（two-hit）”学说。IR可能是促使对肝脏进行第1次打击产生脂肪肝的主要因素[10，11]。而2型糖尿病的主要特征为IR。因此，治疗2型糖尿病脂肪肝的关键在于增加体内胰岛素敏感性，改善IR状态。

桑叶始载于《神农本草经》，味苦甘，性寒，含有丰富的桑叶黄酮。我国《本草纲目》等中医药书籍中有桑叶治疗消渴病的记载。现代药理研究亦证实桑叶中桑叶黄酮可以降低血糖[12]，预防和治疗糖尿病。但其机制尚不清晰。

本实验大鼠模型具有中度IR、中度高血糖等特点，肝脏病理切片证实，肝细胞内出现大小不等的脂滴，脂肪肝形成，大体符合2型糖尿病单纯性脂肪肝的临床特点，造模成功。实验中RGZ组、MLF组与MOD组相比，胰岛素敏感指数升高，IR改善，血糖均下降，桑叶黄酮有显著的降糖作用，与文献一致[12]。桑叶黄酮在降血糖方面同罗格列酮相比，两者之间无统计学差异，表明桑叶黄酮降血糖的功用与罗格列酮接近，显示了其很好的降糖作用。

PPARγ活化后，可以改善机体的IR，其作用机制可能有以下几点：①调节脂肪细胞的内分泌功能；②增强胰岛素信号的传导；③调节机体能量分布；④抑制胰高血糖素的生成[13]。我们用桑叶黄酮灌胃治疗大鼠后，大鼠血清PPARγ平均含量为306 pg/mL，与MOD组相比，有统计学差异（P<0.01），2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠体内PPARγ表达增高；免疫组化结果显示，MLF组肝脏上PPARγ表达与MOD组相比，差异显著（P<0.05）。提示PPARγ表达减弱可能是2型糖尿病单纯性脂肪肝的发病机制之一。经过桑叶黄酮治疗后，2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠血糖和血清胰岛素降低，IR改善。桑叶黄酮对上述几项指标的改善，可能与体内PPARγ的表达增强有关。

总之，桑叶黄酮可能通过增加体内PPARγ的表达，增强胰岛素敏感性、改善IR等途径，治疗2型糖尿病单纯性脂肪肝。其分子机制有待进一步研究。

[参考文献]

[1] Chapman MJ. Metabolic syndrome and type 2 diabetes： lipid and physiological consequences[J]. Diab Vasc Dis Res，2007，4（3）：S5-S8.

[2] Houstis N，Rosen ED，Lander ES. Reactive oxygen species have a causal ro1e in muhipie forms of insulin resistance[J]. Nature，2006，440（7086）：944-948.

[3] Meigs JB，I arson MG，Fox CS，et al. Association of oxidative stress，insulin resistance， and diabetes risk phenotypes：The Framingham offspring study[J]. Diabetes Care，2007，22：446-458.

[4] 苏言辉，祝红梅，夏道曼，等. 桑叶黄酮降低2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠氧化应激水平的研究[J]. 中国公共卫生，2011，27（10）：1225-1226.

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[6] Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J]. Nature， 2001，4（14）：813-820.

[7] 胡爱民，肖凤英，郑云. 2型糖尿病并脂肪肝实验性大鼠模型的建立及评价[J].中国中西医结合消化杂志，2006， 14（3）：156-159.

[8] Valenti L，Rametta R，Dongiovanni P. Increased expression and activity of the transcription factor FOXO1 in nonalcoholic steatohepatitis[J]. Diabetes，2008，57（5）：1355-1362.

[9] Wolfrum C，Asilmaz E，Luca E，et al. Foxa2 regulates lipid metabolism and ketogenesis in the liver during fasting and in diabetes[J]. Nature，2004，432（7020）：1027-1032.

[10] Asnat BD，Nava B. Proposed mechanisms for the induction of insulin resistance by oxidative stress[J]. Antioxidants&Redox Signaling，2005，7（11&12）：1553-1567.

[11] Fridlyand LE，Philipson LH. Reactive species and early manifestation of insulin resistance in type2 diabetes[J]. Diabetes Obes and Metab，2006，8（2）：136-141.

[12] 罗存敏，施新琴，徐升胜，等. 桑叶提取物对小鼠血糖血脂的影响及有效成分的测定[J]. 蚕业科学，2005，4：418-421.

[13] Kurosaki E，Nakano R，Shimaya A，et al. Differential effects of YM440 a hypoglycemic agent on binding to a peroxisome proliferators activated receptor gamma and its transactivation[J]. Biochem Pharmacol，2003，65：795-805.

（收稿日期：2014-03-19）

2.4 各组PPARγ免疫组化图像和结果比较

2.4.1 免疫组化染色结果。

2.4.2各组PPARγ免疫组化结果比较 与NOR组相比，MOD大鼠肝组织中的PPARγ显著减少；MLF组和RGZ组与MOD组相比，肝组织中的PPARγ显著增加；MLF组与RGZ组相比，肝组织中的PPARγ差异无显著性。

3 讨论

糖尿病和脂肪肝是危害人类健康的常见慢性病，两者关系密切。糖尿病可以引起肝脏损伤，其中主要是非酒精性脂肪肝（多为单纯性脂肪肝）。非酒精性脂肪肝病是遗传-环境-代谢应激相关因素所致的以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。主要病因有肥胖、2型糖尿病和血脂紊乱等，并常与这些代谢性疾病伴发出现。关于非酒精性脂肪肝的发病机制[8，9]，得到最广泛认可的是“二次打击（two-hit）”学说。IR可能是促使对肝脏进行第1次打击产生脂肪肝的主要因素[10，11]。而2型糖尿病的主要特征为IR。因此，治疗2型糖尿病脂肪肝的关键在于增加体内胰岛素敏感性，改善IR状态。

桑叶始载于《神农本草经》，味苦甘，性寒，含有丰富的桑叶黄酮。我国《本草纲目》等中医药书籍中有桑叶治疗消渴病的记载。现代药理研究亦证实桑叶中桑叶黄酮可以降低血糖[12]，预防和治疗糖尿病。但其机制尚不清晰。

本实验大鼠模型具有中度IR、中度高血糖等特点，肝脏病理切片证实，肝细胞内出现大小不等的脂滴，脂肪肝形成，大体符合2型糖尿病单纯性脂肪肝的临床特点，造模成功。实验中RGZ组、MLF组与MOD组相比，胰岛素敏感指数升高，IR改善，血糖均下降，桑叶黄酮有显著的降糖作用，与文献一致[12]。桑叶黄酮在降血糖方面同罗格列酮相比，两者之间无统计学差异，表明桑叶黄酮降血糖的功用与罗格列酮接近，显示了其很好的降糖作用。

PPARγ活化后，可以改善机体的IR，其作用机制可能有以下几点：①调节脂肪细胞的内分泌功能；②增强胰岛素信号的传导；③调节机体能量分布；④抑制胰高血糖素的生成[13]。我们用桑叶黄酮灌胃治疗大鼠后，大鼠血清PPARγ平均含量为306 pg/mL，与MOD组相比，有统计学差异（P<0.01），2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠体内PPARγ表达增高；免疫组化结果显示，MLF组肝脏上PPARγ表达与MOD组相比，差异显著（P<0.05）。提示PPARγ表达减弱可能是2型糖尿病单纯性脂肪肝的发病机制之一。经过桑叶黄酮治疗后，2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠血糖和血清胰岛素降低，IR改善。桑叶黄酮对上述几项指标的改善，可能与体内PPARγ的表达增强有关。

总之，桑叶黄酮可能通过增加体内PPARγ的表达，增强胰岛素敏感性、改善IR等途径，治疗2型糖尿病单纯性脂肪肝。其分子机制有待进一步研究。

[参考文献]

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[9] Wolfrum C，Asilmaz E，Luca E，et al. Foxa2 regulates lipid metabolism and ketogenesis in the liver during fasting and in diabetes[J]. Nature，2004，432（7020）：1027-1032.

[10] Asnat BD，Nava B. Proposed mechanisms for the induction of insulin resistance by oxidative stress[J]. Antioxidants&Redox Signaling，2005，7（11&12）：1553-1567.

[11] Fridlyand LE，Philipson LH. Reactive species and early manifestation of insulin resistance in type2 diabetes[J]. Diabetes Obes and Metab，2006，8（2）：136-141.

[12] 罗存敏，施新琴，徐升胜，等. 桑叶提取物对小鼠血糖血脂的影响及有效成分的测定[J]. 蚕业科学，2005，4：418-421.

[13] Kurosaki E，Nakano R，Shimaya A，et al. Differential effects of YM440 a hypoglycemic agent on binding to a peroxisome proliferators activated receptor gamma and its transactivation[J]. Biochem Pharmacol，2003，65：795-805.

（收稿日期：2014-03-19）

2.4 各组PPARγ免疫组化图像和结果比较

2.4.1 免疫组化染色结果。

2.4.2各组PPARγ免疫组化结果比较 与NOR组相比，MOD大鼠肝组织中的PPARγ显著减少；MLF组和RGZ组与MOD组相比，肝组织中的PPARγ显著增加；MLF组与RGZ组相比，肝组织中的PPARγ差异无显著性。

3 讨论

糖尿病和脂肪肝是危害人类健康的常见慢性病，两者关系密切。糖尿病可以引起肝脏损伤，其中主要是非酒精性脂肪肝（多为单纯性脂肪肝）。非酒精性脂肪肝病是遗传-环境-代谢应激相关因素所致的以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。主要病因有肥胖、2型糖尿病和血脂紊乱等，并常与这些代谢性疾病伴发出现。关于非酒精性脂肪肝的发病机制[8，9]，得到最广泛认可的是“二次打击（two-hit）”学说。IR可能是促使对肝脏进行第1次打击产生脂肪肝的主要因素[10，11]。而2型糖尿病的主要特征为IR。因此，治疗2型糖尿病脂肪肝的关键在于增加体内胰岛素敏感性，改善IR状态。

桑叶始载于《神农本草经》，味苦甘，性寒，含有丰富的桑叶黄酮。我国《本草纲目》等中医药书籍中有桑叶治疗消渴病的记载。现代药理研究亦证实桑叶中桑叶黄酮可以降低血糖[12]，预防和治疗糖尿病。但其机制尚不清晰。

本实验大鼠模型具有中度IR、中度高血糖等特点，肝脏病理切片证实，肝细胞内出现大小不等的脂滴，脂肪肝形成，大体符合2型糖尿病单纯性脂肪肝的临床特点，造模成功。实验中RGZ组、MLF组与MOD组相比，胰岛素敏感指数升高，IR改善，血糖均下降，桑叶黄酮有显著的降糖作用，与文献一致[12]。桑叶黄酮在降血糖方面同罗格列酮相比，两者之间无统计学差异，表明桑叶黄酮降血糖的功用与罗格列酮接近，显示了其很好的降糖作用。

PPARγ活化后，可以改善机体的IR，其作用机制可能有以下几点：①调节脂肪细胞的内分泌功能；②增强胰岛素信号的传导；③调节机体能量分布；④抑制胰高血糖素的生成[13]。我们用桑叶黄酮灌胃治疗大鼠后，大鼠血清PPARγ平均含量为306 pg/mL，与MOD组相比，有统计学差异（P<0.01），2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠体内PPARγ表达增高；免疫组化结果显示，MLF组肝脏上PPARγ表达与MOD组相比，差异显著（P<0.05）。提示PPARγ表达减弱可能是2型糖尿病单纯性脂肪肝的发病机制之一。经过桑叶黄酮治疗后，2型糖尿病单纯性脂肪肝大鼠血糖和血清胰岛素降低，IR改善。桑叶黄酮对上述几项指标的改善，可能与体内PPARγ的表达增强有关。

总之，桑叶黄酮可能通过增加体内PPARγ的表达，增强胰岛素敏感性、改善IR等途径，治疗2型糖尿病单纯性脂肪肝。其分子机制有待进一步研究。

[参考文献]

[1] Chapman MJ. Metabolic syndrome and type 2 diabetes： lipid and physiological consequences[J]. Diab Vasc Dis Res，2007，4（3）：S5-S8.

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[4] 苏言辉，祝红梅，夏道曼，等. 桑叶黄酮降低2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠氧化应激水平的研究[J]. 中国公共卫生，2011，27（10）：1225-1226.

[5] Lopes JP，Oliveira SM，Soares Fortunato J. Oxidative stress and its effects on insulin resistance and pancreatic beta-cells dysfunction：Relationship with type 2 diabetes mellitus complications[J]. Acta Med Port，2008，21（3）：293- 302.

[6] Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J]. Nature， 2001，4（14）：813-820.

[7] 胡爱民，肖凤英，郑云. 2型糖尿病并脂肪肝实验性大鼠模型的建立及评价[J].中国中西医结合消化杂志，2006， 14（3）：156-159.

[8] Valenti L，Rametta R，Dongiovanni P. Increased expression and activity of the transcription factor FOXO1 in nonalcoholic steatohepatitis[J]. Diabetes，2008，57（5）：1355-1362.

[9] Wolfrum C，Asilmaz E，Luca E，et al. Foxa2 regulates lipid metabolism and ketogenesis in the liver during fasting and in diabetes[J]. Nature，2004，432（7020）：1027-1032.

[10] Asnat BD，Nava B. Proposed mechanisms for the induction of insulin resistance by oxidative stress[J]. Antioxidants&Redox Signaling，2005，7（11&12）：1553-1567.

[11] Fridlyand LE，Philipson LH. Reactive species and early manifestation of insulin resistance in type2 diabetes[J]. Diabetes Obes and Metab，2006，8（2）：136-141.

[12] 罗存敏，施新琴，徐升胜，等. 桑叶提取物对小鼠血糖血脂的影响及有效成分的测定[J]. 蚕业科学，2005，4：418-421.

[13] Kurosaki E，Nakano R，Shimaya A，et al. Differential effects of YM440 a hypoglycemic agent on binding to a peroxisome proliferators activated receptor gamma and its transactivation[J]. Biochem Pharmacol，2003，65：795-805.

（收稿日期：2014-03-19）