张晓峰，张连峰，程 鹏

郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052

胃癌起源于胃黏膜上皮细胞，在胃的各个部位均可发生。胃癌在世界范围内居肿瘤发病率的第4位，肿瘤死亡率的第2位[1]。中国是胃癌发病率和死亡率较高的国家之一。近年来肿瘤干细胞理论受到人们越来越多的关注。该理论认为肿瘤干细胞是原发性肿瘤组织中一类具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的细胞亚群，是肿瘤生长、转移、复发的根源[2]。Wnt信号通路参与组成干细胞信号网络，与肿瘤的发生发展有关[3]。Wnt1为人类 Wnt基因家族中的第1个成员。研究[4]发现，多个生物学过程中存在Wnt1的异常、异位表达，包括细胞分化、细胞的极性形成、细胞迁移和增殖，表明Wnt1与人类多个系统肿瘤密切相关。作为Wnt信号通路的靶基因，G蛋白偶联受体Lgr5主要表达于肌肉、胎盘、脊髓、脑组织中。近年研究[5]发现Lgr5为肿瘤干细胞标记物之一，在多种肿瘤组织中过表达[6]。作者在该研究中联合检测了胃腺癌组织和相应癌旁正常组织中Wnt1和Lgr5蛋白的表达，探讨二者在胃腺癌发生发展中的作用，为临床诊断、治疗及判断预后提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取郑州大学第一附属医院2012年1月至2013年2月外科手术切除后的存档石蜡标本76例，所有标本均经病理明确诊断为胃腺癌。76例患者中男47例，女29例;年龄29～78岁，中位年龄54岁;均接受胃癌根治术，术前均未行放、化疗和生物免疫治疗;分化程度:高、中分化腺癌31例，低分化腺癌45例;临床分期:Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期31例;有淋巴结转移43例。同时取其中30例患者的癌旁正常胃组织作为正常对照。

1.2 Lgr5和Wnt1蛋白的免疫组化检测 Lgr5和Wnt1兔抗人多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，即用型SP试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。体积分数10%甲醛固定标本，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，常规脱蜡，高温高压修复，严格按照试剂盒说明书进行操作。Lgr5和Wnt1一抗均按1∶100稀释，用PBS代替一抗作空白对照，用已知阳性切片作阳性对照。结果判断:Lgr5阳性染色主要分布于胞膜或胞质内，可见均匀一致的棕色颗粒。每张切片选取5个高倍视野，每个视野计数200个细胞，记录其中的阳性细胞数，阳性细胞百分比＜10%为阴性，≥10%为阳性。Wnt1阳性染色分布于细胞胞膜和胞质中，呈棕黄色或棕褐色。每张切片选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞数＜5%为阴性，≥5%为阳性。免疫组化染色结果由两位高年资病理科医师在双盲条件下进行评定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据。采用χ2检验比较胃腺癌和癌旁正常胃组织Lgr5和Wnt1蛋白表达的差异以及不同一般人口学特征及临床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白表达的差异，采用列联系数分析胃腺癌组织中Lgr5和Wnt1蛋白表达的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 胃腺癌组织及癌旁正常组织中Lgr5和Wnt1蛋白的表达 见图1、表1。

2.2 不同一般人口学特征及临床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白的表达比较 见表2。由表2可知，Lgr5和Wnt1的表达与患者的性别和年龄无关，与肿瘤的大小、TNM分期、分化程度以及淋巴结转移情况有关。

图1 胃腺癌组织(A)及癌旁正常组织(B)中Lgr5和Wnt1蛋白的阳性表达(SP，×200)

表1 胃腺癌组织和癌旁正常胃组织中Lgr5、Wnt1蛋白的表达比较 阳性例数(%)

表2 不同一般人口学特征及临床病理特征的胃腺癌患者Lgr5和Wnt1蛋白的表达比较 阳性例数(%)

2.3 胃腺癌组织中Lgr5和Wnt1蛋白表达的关联性 见表3。胃腺癌组织中Lgr5和Wnt1蛋白的表达呈正关联。

表3 胃腺癌组织中Lgr5和Wnt1蛋白表达的关联性 例

3 讨论

肿瘤干细胞具有无限增殖潜能决定着肿瘤的发生发展和转移，同时也是肿瘤复发、转移和治疗失败的根源。Wnt信号通路广泛作用于机体生长发育过程，参与人体的胚胎发育、干细胞的增殖分化以及肿瘤的形成[7]。G蛋白偶联受体Lgr5是Wnt信号通路的靶基因，为近年发现的肿瘤干细胞标记物之一。Lgr5蛋白由907个氨基酸组成，含有17个富含亮氨酸重复序列的外功能区为其特征性结构。Becker等[8]发现，正常胃肠组织中Lgr5的表达仅仅局限于隐窝基底部，即肠干细胞巢内;而在癌前病变组织中，Lgr5的表达明显升高，并且阳性表达的细胞并不局限于隐窝基底部，这一结果表明肿瘤形成和恶变的早期事件是Lgr5阳性细胞离开干细胞巢，因此Lgr5在肿瘤的发生过程中可能有重要作用。Tanese等[9]发现Lgr5与基底细胞癌的发生密切相关。目前多认为干细胞的Wnt信号通路异常激活后，引起靶基因lgr5的表达升高，可促进干细胞的增殖分化和恶性转化，最终导致肿瘤的形成。该研究结果显示Lgr5在癌旁正常胃黏膜少量散在表达，主要分布在胃腺体的底部及颈峡部，而在胃癌组织中，Lgr5的表达升高，并随着分化程度的降低、淋巴结的转移以及浸润范围和深度的加大加深而升高。目前对Lgr5在信号转导、干细胞的激活和肿瘤形成等过程中的具体作用机制尚不清楚，仍需进一步研究。

Wnt1为Wnt基因家族中发现的第1个成员。1982年首先从小鼠乳癌组织中克隆出这种基因。人类Wnt1基因定位于12q12～12q13，共编码370个氨基酸序列。Wnt通路是一种对细胞增殖和分化具有重要调节作用的信号转导系统，有多种分子参与并相互影响及制约[10]。Wnt1作为此通路中的重要成员之一，是信号转导的始动因子;由于它在胚胎发育、肿瘤发生等重要的病理生理过程中扮演着关键角色，所以目前受到广泛关注。研究[11]发现在Wnt通路中，Wnt1蛋白分泌后作用于细胞表面基质及其特异性受体卷曲蛋白，再经其下游散乱蛋白磷酸化和去磷酸化过程来完成Wnt信号传递，组成Wnt途径。很多肿瘤的发生与Wnt信号异常相关，在胃癌的发生发展中也不乏Wnt信号通路异常的报道[12]。该研究结果显示Wnt-1蛋白在胃癌组织中高表达，并且Wnt1在胃癌组织中的表达与癌组织分化程度、大小、浸润深度及淋巴结转移有关，与既往相关研究[13-14]结果相似。因此Wnt-1可以作为评价胃癌生物学行为较好的指标，同时也为抗癌药物的研究提供了新靶点。

此外，该研究结果还显示，作为Wnt信号通路的靶基因和参与经典Wnt信号通路的重要成员，Lgr5和Wnt1关系密切，推测二者在胃癌的发生发展、浸润和转移过程中可能具有协同作用。寻找敏感的、特定的肿瘤分子标志物在临床肿瘤研究中仍是一个重大的挑战，尤其针对胃癌临床预后差这一事实[15]。Lgr5和Wnt1有望为胃癌的早期诊断和基因治疗提供新的切入点。

[1]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61(2):69

[2]陆士新.肿瘤干细胞及其对肿瘤治疗理念的影响[J].中华肿瘤杂志，2010，32(2):81

[3]Katoh M.Networking of WNT，FGF，Notch，BMP，and Hedgehog signaling pathways during carcinogenesis[J].Stem Cell Rev，2007，3(1):30

[4]张展，李鹤，张琳琳，等.重度子痫前期患者胎盘组织中Wnt1 的表达[J].郑州大学学报:医学版，2013，48(2):184

[5]Vermeulen L，Todaro M，de Sousa Mello F，et al.Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(36):13427

[6]柴宁莉，张文成，王艳敏，等.Lgr5和CD44在肠息肉和结直肠癌中的表达及意义[J].南方医科大学学报，2013，33(7):972

[7]秦大妮，周泽民，沈惠平，等.小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建[J].实用儿科临床杂志，2012，27(13):987

[8]Becker L，Huang Q，Mashimo H.Immunostaining of Lgr5，an intestinal stem cell marker，in normal and premalignant human gastrointestinal tissue[J].Sci World J，2008，8:1168

[9]Tanese K，Fukuma M，Yamada T，et al.G-protein-coupled receptor GPR49 is up-regulated in basal cell carcinoma and promotes cell proliferation and tumor formation[J].Am J Pathol，2008，173(3):835

[10]Reya T，Clevers H.Wnt signalling in stem cells and cancer[J].Nature，2005，434(7035):843

[11]Watanabe O，Imamura H，Shimizu T，et al.Expression of twist and wnt in human breast cancer[J].Anticancer Res，2004，24(6):3851

[12]Khor TO，Gul YA，Ithnin H，et al.A comparative study of the expression of Wnt-1，WISP-1，survivin and cyclin-D1 in colorectal carcinoma[J].Int J Colorectal Dis，2006，21(4):291

[13]韩向春，郑力强，黄勇，等.Wnt1在胃癌中的表达及与临床病理特征的关系[J].广东医学，2010，31(15):1982

[14]刘灿均，蔡圣强，车彦军.Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表达及其病理特征的相关性研究[J].实用临床医药杂志，2011，15(15):3

[15]Filomena A，Saieva C，Lucchetti V，et al.Gastric cancer surveillance in a high-risk population in tuscany(Central Italy):preliminary results[J].Digestion，2011，84(1):70