杨彩玲，张景航，任铭新，张应花，崔卫刚#

1)新乡医学院第一附属医院口腔外科 卫辉 453100 2)新乡医学院病理科 新乡 453003 3)新乡医学院人体解剖学教研室 新乡 453003

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是涎腺最常见的恶性肿瘤之一，具有浸润性强、易远处转移的特点，预后较差。埃克替尼是中国自主研发的一种靶向表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)。研究[1-2]发现，EGFR 和活性氧(reactive oxygen species，ROS)参与了小细胞肺癌等疾病的发生。ROS产生与清除间的动态平衡对维持细胞的生存与凋亡非常重要。抗氧化酶是清除ROS引起的氧化损伤的主要成员;MnSOD能歧化超氧阴离子形成过氧化氢，清除ROS引起的氧化损伤，是线粒体中重要的抗氧化酶[3-4]。作者观察了埃克替尼对ACC-M细胞凋亡以及MnSOD在线粒体的表达和对ROS生成的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ACC-M细胞株由上海交通大学口腔医学院惠赠。ACC-M细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的培养液中，置于体积分数5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。埃克替尼由浙江贝达药业有限公司惠赠，用DMSO溶解，分装后－20℃保存。DCFH-DA试剂(Molecular Probes公司)，Caspase-3活力检测试剂盒(Sigma公司)，MnTMPyP(Calbiochem Merk公司)，兔抗MnSOD一抗(Santa Cruz公司)，抗兔二抗(KPL公司)。

1.2 细胞分组 实验分为6组:对照组，低、中、高剂量埃克替尼组(10、20、40 μmol/L 埃克替尼处理 24 h)，MnTMPyP 组(10 μmol/L MnTMPyP 处理 24 h)，MnTMPyP+埃克替尼组(10 μmol/L的MnTMPyP预孵育1 h，再加入40 μmol/L埃克替尼处理24 h)。

1.3 ACC-M细胞Caspase-3蛋白活力的检测 根据试剂盒说明书步骤进行。收集处理后的各组细胞，在冰上用裂解液孵育30 min，16000 r/min 4℃离心10 min，收集上清液，用底物37℃孵育90 min，Caspase-3活力用分光光度计在405 nm进行测量。标准曲线的绘制:试剂盒提供的4-硝基苯胺用标准品稀释液稀释为 0、10、20、50、100 和 200 μmol/L，作为标准品并绘出标准曲线，与标准曲线对比计算样品中Caspase-3蛋白的活力。实验重复3次。

1.4 ACC-M细胞活性的检测 向各孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，37℃孵育4 h，1000 r/min离心5 min，弃去培养液，加入相应药物进行干预，振荡10 min，测定490 nm波长处的吸光度。细胞活性=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。实验重复3次。

1.5 ACC-M细胞ROS水平的检测 ROS含量用DCFH-DA荧光探针进行检测。细胞在含10 mmol/L DCFH-DA的培养基中孵育30 min，经埃克替尼和(或)MnTMPyP处理细胞后，荧光分光光度计测定细胞内ROS水平值(激发波长488 nm，发射波长530 nm)。ROS水平=实验组荧光强度/对照组荧光强度×100%。实验重复3次。

1.6 ACC-M细胞总蛋白、线粒体及胞质中Mn-SOD蛋白表达水平的检测 细胞线粒体和胞质蛋白提取参照线粒体提取试剂盒说明书进行。收集各组处理后的细胞，加入预冷的Mito-cytoBuffer重悬细胞，1000 r/min离心5 min。取上清，4℃、1000 r/min离心5 min。再取上清，4℃、12000 r/min离心10 min。取上清即为胞质，提取胞质蛋白，用于胞质蛋白成分的检测。线粒体沉淀位于管底，加入0.2 mL Mito-CytoBuffer重悬，12000 r/min离心10 min，弃上清;全细胞蛋白裂解缓冲液重悬沉淀，测蛋白浓度，保存备用。采用BCA法测定提取蛋白浓度，配置体积分数5%浓缩胶和10%分离胶进行蛋白电泳，电泳结束后电转移到PVDF膜，加入兔抗MnSOD一抗，4℃孵育过夜，TBST清洗 10 min×3次，加入抗兔二抗，室温孵育2 h，ECL发光、显影和定影。β-actin为内参。成像分析仪扫描并保存，目的蛋白的表达水平用目的蛋白和内参蛋白灰度值的比值表示。实验重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据，采用单因素方差分析比较各组细胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS的水平及MnSOD蛋白表达水平的差异，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组细胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS水平的比较 见表1。由表1可见，不同浓度的埃克替尼可以抑制ACC-M细胞活性，诱导ACC-M细胞Caspase-3的活力增加，促进ACC-M细胞ROS的生成，而MnTMPyP可拮抗上述变化。

表1 各组细胞活性、Caspase-3蛋白活力、ROS水平的比较(n=3) %

2.2 各组细胞总蛋白、线粒体及胞质中MnSOD蛋白的表达水平 见图1，表2。埃克替尼处理引起了MnSOD由线粒体向细胞质的释放。MnTMPyP预处理ACC-M细胞1 h能逆转埃克替尼引起线粒体Mn-SOD向胞质的转位。

图1 各组细胞MnSOD蛋白的表达

表2 各组细胞线粒体和胞质MnSOD蛋白的表达比较(n=3) %

3 讨论

细胞凋亡是基因控制的细胞主动死亡过程。目前认为，细胞凋亡与肿瘤的发生发展关系密切。Caspase-3通过抑制DNA修复，启动DNA的降解，导致细胞死亡。埃克替尼是一种EGFR-TKI，可抑制人鳞状上皮细胞癌A431细胞系等肿瘤细胞的生长和增殖[5-6]。该研究结果显示:埃克替尼在较低浓度时即可抑制ACC-M细胞的增殖，诱导ACC-M细胞中Caspase-3凋亡相关蛋白的活力增加，说明埃克替尼能诱导ACC-M细胞发生凋亡。

ROS与肿瘤形成密切相关，是多种药物诱导细胞发生凋亡的一个重要信号分子。研究[7-8]显示ROS与EGFR-TKI促肿瘤细胞凋亡的作用有关。该研究发现，埃克替尼可促进ACC-M细胞ROS的产生，与上述研究相符。此外，该研究还发现利用MnTMPyP预处理ACC-M细胞1 h能阻断埃克替尼诱导的凋亡相关蛋白Caspase-3活力的增加，表明ROS在埃克替尼诱导ACC-M细胞凋亡过程中发挥着重要作用。

MnSOD是线粒体中非常重要的抗氧化因子。MnSOD歧化超氧阴离子形成过氧化氢，使超氧阴离子失去氧化能力。MnSOD蛋白先在胞质中翻译形成然后转位到线粒体;MnSOD蛋白的正确定位对其发挥功能非常重要[9]。该研究显示，MnSOD模拟物MnTMPyP能够阻断埃克替尼诱导凋亡相关蛋白Caspase-3活力的增加，据此推测，MnSOD可能在埃克替尼诱导ROS生成过程中发挥着重要作用。此外，该研究还显示埃克替尼处理后，MnSOD蛋白在ACC-M细胞线粒体的表达减少，在胞质中的表达增加。推测MnSOD从线粒体向胞质的转位可能参与了埃克替尼诱导的细胞凋亡;MnSOD不能及时清除线粒体呼吸链上产生的氧离子，从而引起细胞ROS的积累。

综上所述，埃克替尼诱导了Caspase-3蛋白活力增强和ROS的生成，ROS在埃克替尼诱导ACC-M细胞凋亡过程中发挥着重要作用，该作用可能与MnSOD从线粒体向胞质转位有关。

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