李 超，钱新华，千新来，付琳琳，吴 余

1)南方医科大学南方医院新生儿科 广州 510515 2)新乡医学院病理学教研室 新乡 453003

白血病是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，白血病细胞的生长特点是增殖失控、凋亡受阻及分化障碍[1]。黄芪为豆科植物属蒙古黄芪、膜荚黄芪的干燥根，黄芪多糖(astragalus polydsaccharide，APS)是黄芪的主要活性成分之一[2-3]，具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、抗应激、抗病毒、抗辐射、抗氧化等多种药理功效[4-8]。研究[7-8]发现APS在体内外对多种恶性肿瘤有明显的抑制作用。许杜娟等[8]发现，黄芪总提取物能明显抑制小鼠实体型肿瘤的生长，并可引起肝癌细胞系发生凋亡;而刘兵荣等[9]研究发现，APS可通过抑制核因子NF-κB表达而抑制大鼠脑出血后的细胞凋亡，提示APS与细胞凋亡的关系及相关机制值得深入研究。作者采用流式细胞术、Caspase-3活性测定等方法，通过RT-PCR和 Western blot方法检测 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、IAP-1和Smac mRNA和蛋白的表达，探讨APS对人红白血病K562细胞凋亡的影响及机制，以期为APS用于白血病的治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系来源及培养 K562细胞购自中科院上海细胞库，用含体积分数10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和青/链霉素(青霉素 100 U/mL，链霉素100 mg/L)的RPMI 1640培养基，于37℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2 主要试剂 FBS为杭州四季青公司产品;RPMI 1640培养基、Trizol试剂、100 bp DNA Marker为美国Invitrogen产品;RT-PCR试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs为日本TaKaRa公司产品;所有抗体及增强化学发光(ECL)试剂盒均为美国Santa Cruz公司产品;Annexin V-FITC/PI试剂盒购于碧云天生物技术研究公司;CaspACETM Assay System、Colorimetric试剂盒为Promega公司产品。

1.3 PCR引物序列和目的片段长度 PCR引物由英潍捷基上海公司合成。引物序列和目的片段长度见表1。

表1 PCR引物序列和目的片段长度

1.4 细胞凋亡的检测 收集K562细胞(对照组)和200 mg/L APS诱导48 h的K562细胞(APS组，根据预实验结果选择该剂量和时间)并计数细胞数。用195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入 5 μL Annexin V-FITC，避光孵育 10 min，1000 r/min 离心 5 min，弃上清，用 190 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，避光冰上孵育后，上流式细胞仪计数凋亡细胞数。实验设3个平行样本。

1.5 细胞中Caspase-3活性测定 提取对照组和APS组K562细胞总蛋白并定量。按试剂盒说明书进行Caspase-3活性测定。96孔板中依次加入如下成分制备反应混合物:Caspase分析缓冲液32 μL、二甲基亚砜 2 μL、二硫苏糖醇(100 mmol/L)10 μL、蛋白 62.5 μg，补水至 98 μL。每组均设 3 个复孔，同时设不加蛋白的空白对照孔。加AC-DEVA-PNA底物2 μl/孔，避光，37 ℃温育 4 h，测定 405 nm 处的光密度值(OD)，计算各组均值，并以各组均值与空白对照均值的差值表示Caspase-3活性。

1.6 细胞中凋亡相关基因mRNA的RT-PCR检测 提取对照组和APS组K562细胞总RNA并定量，体外合成cDNA第一条链，以cDNA为模板进行PCR反应。通过Bandleader 3.0软件分析PCR扩增产物目的条带与内参照条带的灰度比值。

1.7 细胞中凋亡相关基因蛋白的Western blot检测 提取对照组和APS组K562细胞总蛋白并定量，通过Western blot方法检测细胞凋亡相关基因蛋白。以β-actin为内参照。上样量为100 μg，鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、兔抗人Bcl-XL多克隆抗体、鼠抗人Bax单克隆抗体、兔抗人Smac多克隆抗体、兔抗人IAP-1多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔二抗和辣根酶标记的兔抗鼠二抗的稀释度分别为 150、100、150、150、100、300、2500和2500倍。通过Bandscan 5.0软件分析目的条带灰度值与内参照条带灰度值的比值。

1.8 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析。应用两独立样本的t检验比较2组K562细胞凋亡细胞数及细胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、IAP-1 和 Smac mRNA和蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 APS对K562细胞凋亡的影响 APS组K562细胞凋亡数(3322.000±413.849高于对照组(101.333 ±18.339)，差异有统计学意义(t=13.466，P ＜0.001)。

2.2 APS对K562细胞中Caspase-3活性的影响与对照组(0.085±0.018)相比，APS组 K562细胞中 Caspase-3 活性(0.354 ±0.036)升高(t=11.562，P ＜0.001)。

2.3 APS 对 K562 细胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1表达的影响 见图1、2和表2、3。

图1 APS对K562细胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1 mRNA表达水平的影响

图2 APS对K562细胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1蛋白水平表达的影响

表2 2组细胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1 mRNA的表达

表3 2组细胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和 IAP-1蛋白的表达

3 讨论

正常情况下细胞的增殖与凋亡处于动态平衡中，以维持机体的自身稳定性。细胞增殖失控和(或)凋亡受阻均可导致肿瘤发生。细胞凋亡受一系列基因调控。Caspase家族是调控细胞凋亡的关键分子，其家族成员均具有半胱氨酸蛋白酶活性，其中Caspase-8和Caspase-9位于凋亡途径的上游，分别介导死亡受体途径和线粒体途径细胞凋亡，Caspase-3为凋亡的效应因子，被称为凋亡“执行者”，它们的级联激活引发细胞发生凋亡[10-11]。研究[12]发现，许多中药或其有效成分可诱导肿瘤细胞凋亡。该研究结果显示，APS组K562细胞凋亡数高于对照组;与对照组相比，APS组K562细胞中Caspase-3活性显著增加，说明APS能诱导K562细胞发生凋亡。

Bcl-2家族是对Caspase的激活进行调控的一类重要的蛋白因子，Bcl-2家族蛋白主要通过线粒体途径参与凋亡调控。根据在凋亡中所起作用，可将Bcl-2家族蛋白分为两大类型:抑制凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(如 Bax等)。Bcl-2、Bcl-XL可抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，而Bax通过其编码产物与Bcl-2蛋白形成异源二聚体使其失活，从而激活Caspase或独立地破坏核内染色质，引起细胞凋亡[13-14]。谷俊朝等[15]研究发现，APS 可抑制乳癌中Bcl-2的表达，促进乳癌细胞的凋亡。该研究结果显示，与对照组相比，APS组K562细胞中Bcl-2在mRNA和蛋白水平的表达均显著降低，而Bax在mRNA和蛋白水平表达均显著增加，Bcl-XL在mRNA和蛋白水平的表达差异均无统计学意义。说明APS诱导K562细胞凋亡的机制可能与其下调Bcl-2的表达和上调Bax的表达密切相关，而Bcl-XL可能在APS诱导K562细胞凋亡中不起重要作用。

研究[16]发现，Smac可通过与IAPs结合或通过增强IAPs的自身泛素化降解以释放Caspases而发挥其促凋亡活性。反之，Livin、XIAP等也可通过减少Smac的释放或诱导Smac的泛素化降解而发挥抑制凋亡的作用[17-18]。该研究结果显示，与对照组相比，APS组K562细胞中IAP-1在mRNA和蛋白水平的表达均显著降低，而Smac在mRNA和蛋白水平表达均显著增加。IAP-1表达下调和Smac表达上调在APS诱导K562细胞凋亡中也发挥重要作用。

综上所述，APS可以诱导K562细胞凋亡，APS的上述作用与抗凋亡基因Bcl-2和IAP-1表达下调及促凋亡基因Smac和Bax表达上调有密切关系。但APS诱导K562细胞凋亡的分子机制可能非常复杂，值得进一步深入研究。

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