胡小宁，黄学勇，杜燕华，尤爱国，许汴利#

1)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001 2)河南省疾病预防控制中心传染病防治所 郑州 450016

发热伴血小板减少综合征是近年来发生在我国河南、湖北、山东等地区的一种新发传染病，2010年河南信阳报道“蜱咬人致死”事件后，该病备受各界关注。研究[1-2]证实发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)是引起该综合征的病原体。SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉热病毒属，与其他布尼亚病毒科病毒相类似，其基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个单股负链RNA组成;其中S片段属于双义RNA，分别编码核蛋白(nucleocapsid protein，NP)和非结构蛋白[3-4]。在布尼亚病毒感染的临床病例中，病毒NP是主要的免疫原，患者体内相应的抗体水平较高[5-6]。目前以部分布尼亚病毒科病毒NP作为目标抗原的检测试剂已广泛应用于实验室检测，如裂谷热病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV) 等[5，7]。该研究拟构建SFTSV NP的原核表达载体并表达、纯化，获取具有抗原性的重组NP;以纯化的NP作为诊断抗原，建立检测血清样本中NP抗体的ELISA检测方法，为后续血清学检测试剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、毒株和标本 菌株E.coli JM109和克隆载体pMD18-T购自大连宝生物工程有限公司，原核表达载体pMAL-c2x、SFTSV毒株SH105均由郑州大学公共卫生学院流行病学教研室保存。体检健康人血清(48份)和信阳SFTSV流行区临床诊断为SFTSV感染者急性期血清(96份)标本由该教研室保存。

1.2 主要试剂和仪器 RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，SFTSV RNA检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)购自北京华大吉比爱生物技术有限公司，逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司，限制性内切酶XbaⅠ、HindⅢ以及其他酶类均购自大连宝生物工程有限公司，胶回收试剂盒购自杭州艾斯进公司，质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，IPTG、X-Gal、NC 膜、鼠抗人 IgG、HRP 标记羊抗人IgM以及TMB底物、显色试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、蛋白半干转膜仪、酶标仪均购自BIO-RAD公司，Amylose树脂预装柱、蛋白纯化仪均购自GE公司，其他试剂为国产分析纯。

1.3 引物设计 参照 BX-2010/Henan/CHN strain河南分离株HQ642768.1基因组序列，利用Primer 5.0设计针对NP基因的PCR上游引物序列(NK1-1:5'-GCTCTAGAATGTCAGAGTGGTCCAGAAT-3')和下游引物序列(NK1-2:5'-CGCAAGCTTTTACAGGT TCCTGTAAGCAG-3')，分别在上、下游引物序列引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 NP基因PCR扩增 取SFTSV细胞培养物140 μL提取病毒RNA，逆转录为cDNA后通过PCR扩增NP基因。50 μL的反应体系中加入Extaq 25 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 1 μL，最后加不含RNase ddH2O至终体积。扩增条件:95℃预变性3 min;94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环;72℃延伸10 min。扩增产物以15 g/L琼脂糖电泳鉴定。

1.5 NP原核表达载体的构建和鉴定 PCR产物回收后与pMD18-T载体连接并转化至JM109感受态细胞中，转化产物均匀涂抹于LB固体培养基(氨苄青霉素 100 mg/L，IPTG 24 mg/L，X-Gal 40 mg/L)，于37℃条件下培养过夜。挑选阳性单克隆菌落培养后提取质粒，酶切鉴定并送至南京金斯瑞科技有限公司进行测序。分别将测序正确的重组质粒和表达载体pMAL-c2x经XbaⅠ、HindⅢ双酶切后回收目的片段，回收产物连接、转化至JM109感受态细胞中。菌液提取质粒后酶切鉴定。

1.6 目的蛋白的诱导表达 取酶切鉴定正确的菌液按1∶100体积比接种于LB液体培养基(氨苄青霉素100 mg/L)，37℃振荡培养至OD≈0.5时，加入不同浓度的IPTG(0.8和1.0 mmol/L)分别诱导培养 3.0、3.5、4.0、4.5 h 以确定蛋白适宜表达条件。在优化后的诱导条件下大量诱导表达菌液200 mL，离心收集菌体于－40℃保存备用。

1.7 表达产物的纯化和Western blot分析 将诱导表达后的产物于室温融化，加入10 mL PBS重悬浮，离心弃上清后加10 mL过柱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCL，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DDT，pH=7.4)冰浴超声 10 min。4 ℃8000 g离心5 min后分别取上清和沉淀行SDSPAGE，电泳后考马斯亮蓝R250染色并观察。超声后的上清液经0.22 μm滤纸过滤并过Amylose树脂预装柱(按仪器操作步骤进行)，最后用洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCL，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L maltose，1 mmol/L DDT，pH=7.4)洗脱收集蛋白，SDS-PAGE观察纯化结果。电泳后将纯化蛋白转移至硝酸纤维素膜上，50 g/L脱脂牛奶封闭1 h;封闭后加入SFTSV急性期患者血清(按1∶50稀释)孵育1 h，同时以健康人血清作为对照;加碱性磷酸酶(AP)标记的鼠抗人IgG(按1∶1000稀释)孵育1 h显色观察。

1.8 ELISA方法的建立与检测效果的评价 用包被缓冲液将纯化的 NP稀释至10 mg/L，每孔150 μL包被酶标板，4℃过夜，PBST洗涤3次;加入150 μL 封闭液37 ℃封闭2 h，加入100 μL 待测血清(按1∶10稀释)37℃孵育30 min;洗板后加入100 μL HRP标记羊抗人 IgM(按1∶1000稀释)，37℃反应30 min;每孔分别加入底物TMB溶液和显色液50 μL，37℃反应10 min;最后加入终止液50 μL。酶标仪于450 nm处测定OD值。对48例健康人血清样本进行检测，以P/N≥2.1为阳性判定标准值，以建立的ELISA法和实时荧光定量PCR法(逆转录50℃30 min;95℃预变性15 min;95℃变性15 s，60℃退火40 s并收集FAM荧光信号，40个循环。检测结果Ct值≤35为阳性)同时对96份SFTSV感染者样本进行检测，确定ELISA方法的可靠性。

2 结果

2.1 目的基因的扩增 测序结果显示，SFTSV NP的基因长度为738 bp。该基因与GenBank上Orthobunyavirus 69号分离株(登录号JF682778.1)的NP基因序列完全相同。

2.2 重组表达载体 pMAL-c2x-NP的鉴定pMAL-c2x-NP小提质粒后经XbaⅠ、HindⅢ双酶切获得结果相一致的目的条带(图1)，表明重组表达质粒构建成功。

2.3 重组蛋白的表达、纯化和Western blot分析不同浓度的IPTG均可诱导目的蛋白的表达，随着诱导时间的增加，融合蛋白的表达量有所增加，表达量差异并不明显(图2)。该实验选取IPTG终浓度为1 mmol/L，诱导表达4 h。融合蛋白的可溶性结果分析显示，目的蛋白虽然主要以包涵体形式表达，但上清中可溶性重组蛋白含量可满足通过Amylose树脂预装柱纯化的需要(图3)。Western blot结果显示SFTSV感染者血清与融合蛋白在约70000处有一条特异杂交带，融合蛋白对识别SFTSV感染者血清具体良好的特异性(图4)。

图1 pMAL-c2x-NP的酶切鉴定结果

图2 不同诱导条件下pMAL-c2x-NP的表达

图3 重组蛋白的可溶性分析结果

图4 纯化融合蛋白的Western blot分析

2.4 ELISA方法的检测效果 48份健康人血清抗NP抗体OD值的平均值=0.099。以建立的方法对96例临床诊断SFTSV急性期患者血清标本进行检测，阳性率为40.6%(39/96);实时荧光定量 PCR法检测的阳性率为55.2%(53/96)。两者符合率为77.1%，一致性检验较好，见表1。

表1 2种检测方法检测结果的一致性检验

3 讨论

近年来，虫媒病毒严重威胁着人类的健康[8]。作为一种蜱传新发传染病，目前已建立多种针对SFTSV的实验室检测方法，包括病毒分离、RT-PCR、IFA以及实时荧光定量PCR等[9-10]，而上述方法对实验设备和实验人员都有较高的要求。血清学的检测既能弥补基层实验条件的不足，又可用于流行病学调查。NP在病毒颗粒内通过与病毒基因组RNA和RNA聚合酶结合形成NP体(ribonucleoprotein，RNP)，同时又具有同型寡聚化和RNA结合的特性，这些特性使得NP在病毒的转录、复制过程中起着重要的作用。针对SFTSV构建的合成噬菌体抗体库的研究[11]表明，94种人源多克隆抗体均可识别SFTSV的NP，而不与外膜蛋白发生反应。研究[12]也显示利用SFTSV感染者血清检测NP的病毒颗粒和重组蛋白，结果均呈现强阳性，而其他的靶标蛋白如外膜蛋白等结果具有不稳定性，可见NP特异性抗体在SFTSV感染者血清中的表达水平较高。针对NP的单克隆抗体研究[13-14]也显示在检测临床病例中NP较高的亲和力与高度的特异性，这些都证明NP在SFTSV早期诊断过程中起着至关重要的作用。而河南、山东、湖北等地发现的SFTSV基因组序列高度同源，这为后续实验的广泛应用提供了保障。

有研究[15]利用pEASY-E1表达系统获取蜱传森林脑炎病毒的非结构蛋白。该实验采用的原核表达载体pMAL-c2x含有强启动子tac，可以高效表达外源蛋白。作者在实验过程中发现上清中融合蛋白的表达量完全可满足纯化的需要，这可能是该载体具有E.coli malE翻译起始信号，可引导融合蛋白穿过胞质膜进入周质有关。MBP的相对分子质量为42000，因此NP的相对分子质量大约在28000，与文献[12]报道一致。利用该蛋白构建的ELISA检测方法和实时荧光定量法对临床血清样本检测的结果符合率为77.1%。研究[16]显示当血清样本采样时间小于3 d时，仅能通过实时荧光定量PCR检测;同时由于ELISA方法在实验条件方面还需进一步优化，这可能是两者结果差异的原因。

该研究通过构建SFTSV NP基因的原核表达载体，优化融合蛋白的表达条件，经过亲和层析后获得纯化的重组融合蛋白。经Western blot证实该融合蛋白具有抗原性，用建立的ELISA方法对临床样本做了初步检测，为后续的SFTSV血清学检测试剂的研发提供了物质基础。

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