梁涛

(郑州大学第一附属医院药剂科，郑州 450052)

顺铂已经广泛应用于临床治疗各种癌症，其药理作用机制是阻止双螺旋的解螺旋和分离，阻止细胞的分裂并最终导致细胞凋亡[1-3]。然而，65% ～98%的顺铂与血浆蛋白结合，导致药物失活，降低顺铂治疗效果[4-6]。另外，多数抗肿瘤药物具有极高的生物毒性且缺少特异选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会影响到正常对照组织细胞[7-10]。为提高药物靶向性，笔者应用酸响应的聚合物-铂共轭的纳米体系，将顺铂负载聚合物纳米颗粒(nanometer particle，NP)中[11]，合成具有酸响应特性的药物载体，在酸性环境的肿瘤部位下释放出药物，从而延长药物半衰期，并且可以同时递送两种或更多药物用于联合治疗以便产生协同作用，并降低耐药性[8]，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 羟基-聚乙二醇-聚肥酸共聚物(HOOCPEG-PLA-NH-NH2，参照文献[12]合成)，四氯铂酸钾(K2PtCl4)以及其他用于化学合成顺铂的试剂购买自Sigma-Aldrich，细胞培养试剂和培养液购买自Media Tech，噻唑蓝(thiazolyl blue，MTT)细胞增殖测定试剂盒购自美国普洛麦格公司。A2780人卵巢癌细胞由UCSD Moores癌症中心Stephen Howell博士提供。

1.2 方法

1.2.1 合成 PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2首先按照文献合成PtCl2(OH)2(NH3)2，之后用其合成PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2[13]。将过量的乙酰丙酸酐于回流下加入到含有PtCl2(OH)2(NH3)2100 mg(0.3 mmol)的丙酮溶液中，反应12 h后，加入冷水水解过量的酸酐，将反应混合物于2℃下放置16 h。在减压下除掉丙酮，得到白色残渣，将残渣分别用水、乙醇和乙醚进行洗涤而纯化，得到最终产物，产率为39.0%。

1.2.2 聚合物-顺铂前体药物共轭体Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)的合成 将HOOC-PEG-PLA-NH-NH2与PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2以剂量比1∶8溶解在二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺溶液(体积比1∶1)30 mL中，于氮气(N2)氛围中50℃回流状态下反应48 h。将粗产物在乙醚中反复沉淀进行纯化，随后用水和三氯甲烷进行萃取。将得到的纯化的Bi(PEGPLA)-Pt(IV)保存在－20℃备用。其产率为28.3%。

所合成的共轭体Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)的核磁表征数据为:1H NMR(CDCl3，400 MHz):1.2(t，3 H，J=7.0 Hz)，1.55(m，3H)，2.1(s，3H)，2.9(d，2H，J=2.8 Hz)，3.47(q，2H，J=7.0 Hz)，3.63(m，2H)5.15(m，1H)，8.0(br，3H)，8.2(br，1H)。

1.2.3 聚合物-顺铂前体药物共轭体NP的制备 NP通过纳米沉淀的方法制得。将Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共轭体10 mg溶解在乙腈3 mL中并在连续搅拌下加入到含水10 mL的小瓶中。当纳米沉淀完成后，将有机溶剂除去。之后将NP溶液用截留相对分子质量为104的Amicon Ultra-4离心过滤器(Millipore Billerica，MA)过滤3次。得到的纳米颗粒的形态和大小利用扫描电镜进行表征。

1.2.4 药物负载和药物释放研究 为了研究顺铂从Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的释放，将制备的NP溶液100 μL放入截留相对分子质量3.5×103的 Slide-ALyzer MINI渗析管中，之后于37 ℃在pH=5.0，6.0 和7.4 的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)缓冲溶液中渗析，每隔12 h更换PBS。在每个预定时间点从3个小渗析单元中采集NP溶液用于药物含量量化以及顺铂浓度量化。

1.2.5 聚合物降解研究 将聚合物NP在pH=5.0，6.0，7.4的PBS中于37℃下温育，测定聚合物降解。在每个时间点采集NP样品，利用三氯甲烷萃取，并在冰冷的乙醚下再次沉淀。利用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)来确定聚合物相对分子质量的变化。

1.2.6 包封率、载药量和药物利用率 采用葡聚糖凝胶过柱的方法分离被包裹药物和游离药物。此法是利用葡聚糖凝胶的分子筛作用，将纳米粒大分子与游离药物小分子分离，计算公式为:包封率(entrapment rate，ER)=WL/WT ×100%;载药量(drug loading，DL)=WL/WP ×100%;药物利用率(recovery，R)=WT/WD×100%(WT:药物总量，WL:包裹于纳米粒中的药物量，WP:制备纳米粒时 PLGA注药量，WD:药物用量)，聚合物 NPER、DL、R 分别为:11.24%，1.25% 和99.43%。

1.2.7 细胞毒性分析 应用 MTT检测法评估 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP对A2780人卵巢癌细胞的细胞毒性，首先将A2780人卵巢癌细胞接种在96孔板内(细胞密度每孔2×104个)，培养24 h。然后更换新鲜培养液150 μL，并加入Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP溶液50 μL，培养4 h后去除过量的NP，用新鲜培养液洗涤细胞3次后加入新鲜培养液。继续培养72 h后通过MTT试剂测定细胞存活情况。新鲜细胞培养液和PEG-PLA NP作为阴性对照，各浓度下的游离顺铂作为阳性对照[13]。

1.2.8 统计学方法 利用统计学分析评估Bi(PEGPLA)-Pt(IV)共轭体NP对A2780人卵巢癌细胞增殖的影响，利用t检验对连续数据进行组间比较，并用Kaplan-Meier方法进行生存率分析，统计学分析软件为NCSS 97版，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共轭体NP形态表征 从Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共轭体NP的扫描电镜图中(图1)，可以看出所形成的纳米颗粒呈现较均一的胶束形态，其粒径为(82.0 ±3.0)nm，粒径 ＜100 nm，这与相应的PEG-PLA聚合物NP所呈现的粒径相似。

图1 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共轭体NP的扫描电镜图(×200)Fig.1 Scanning electron microscope image of Bi(PEGPLA)-Pt(IV)conjugate NP(×200)

2.2 药物负载、释放以及聚合物的降解 利用电感耦合等离子体光发射谱测定NP的顺铂负载率(即负载到NP中的顺铂占加入顺铂总量的比例)。根据药物释放动力学，分别以顺铂负载率和时间为纵横坐标轴作图，见图2所示，在聚合物-前体药物共轭体制备过程中加入的Pt(IV)前体药物越多，其顺铂的药物负载率就越高。初始Pt(IV)/PEG-PLA反应比为2∶1，4∶1和6∶1时，得到的顺铂药物负载率分别为(0.35 ±0.01)%，(0.89 ±0.02)%和(1.05 ±0.03)%(P＜0.01)。当Pt(IV)/PEG-PLA的摩尔比高于6∶1时，药物负载率无显著升高迹象。

图2 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP在各种初始Pt(IV)/PEG-PLA反应摩尔比下的顺铂负载率Fig.2 Cisplatin loading yield of Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NPs at various initial Pt(IV)/PEG-PLA reaction molar ratios

顺铂在3 个不同的 pH(5.0，6.0 和7.4)时的释放动力学曲线见图3，顺铂在pH=5.0和6.0时的释放率显著高于pH=7.4的释放率。当顺铂负载率为1.05%时，pH=5.0和6.0的环境中 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP释放50%的药物时分别需要4和6 h，在pH=7.4时需要22 h。该释放量的差别在药物开始释放的最初几个小时最为明显——在开始的前2 h内，pH=5.0和6.0时顺铂释放率分别为17%和15%，而在pH=7.4时仅为2%。

图3 顺铂从Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的释放曲线Fig.3 Cisplatin release profile from Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NPs

选定不同的时间点，分别采集PEG-PLA NP样品，利用GPC来测定聚合物的相对分子质量，见图4所示，培养50 h 后，在 pH=5.0，6.0 和7.4 时，聚合物相对分子质量分别降低20%，18%和8%，验证了PLA作为生物可降解聚合物，在中性和酸性环境中可水解为较小的片段或单体。

图4 PEG-PLA NP 在 pH 5.0，6.0 和7.4 时的降解率Fig.4 Hydrolytic degradation rate of PEG-PLA NPs at pH 5.0，6.0，and 7.4

2.3 细胞毒性分析结果 本实验选取A2780人卵巢癌细胞作为模型癌细胞，通过MTT检测法检测了 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的体外细胞毒性。培养4 h后Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的细胞生存能力降低至65%(P＜0.01)，而PEG-PLA NP对卵巢癌细胞的细胞毒性可忽略不计，同样细胞培养液对照组也未显示出明显的细胞毒性。在10，50 和 100 μmol·L－1下的游离顺铂的细胞生存能力分别为99%(P＜0.05)，62%(P＜0.01)和35%(P ＜0.01)。另外在本实验中包裹在Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的铂化合物只相当于7 μmol·L－1游 离 的 顺 铂，然 而 却 起 到 了 与50 μmol·L－1游离的顺铂的细胞毒性效果。可见酸响应药物载体Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP显著提高了药物的生物利用度。然而笔者并未对Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP对正常细胞的影响进行研究，这是有待完善之处。

3 讨论

随着靶向治疗的深入，纳米药物载体在肿瘤治疗中显示出广阔的应用前景。PEER等[14]将多柔比星通过可酸解的腙键共价结合到聚乙二醇聚合物上，其中连接多柔比星与聚合物的腙键响应于pH的刺激，从而延长多柔比星在血液中的循环时间，并且由于增强渗透滞留效应使得更多的多柔比星在肿瘤处聚集，减少了不良反应，在上述研究的基础上，笔者对顺铂的纳米囊进行了研究，以提高顺铂的生物利用度和治疗效果。

结果发现，本研究合成的Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的粒径＜100 nm，符合对体内药物载体材料的大小要求，能够有效地逃脱体内清除机制，提高药物的生物利用度。同时，该共轭聚合物纳米粒径与未共轭顺铂的PEG-PLA NP所形成的粒径差别不大，说明共轭顺铂之后并没有影响聚合物NP的形成。药物负载实验显示，初始Pt(IV)/PEG-PLA反应摩尔比增加到8∶1时，聚合物链与顺铂的结合已经达到饱和状态，所有PEG-PLA聚合物已经全部与Pt(IV)发生共轭，药物负载率没有显著提高。药物的释放实验表明，顺铂从Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的释放是pH依赖型的，这主要是由于顺铂是通过腙键而共轭于聚合物链上的，而腙键是一种酸响应键。在pH=5～6时，腙键可在几分钟内迅速断裂以释放出药物，从而使药物从NP中扩散出来。在pH=7时，腙键相对稳定，所观测到的顺铂释放，可能是由于共轭连接顺铂前体药物的可降解聚合物PLA的降解造成的。通过上述实验可得出结论，在3种pH下培养24 h后聚合物相对分子质量的降低水平几乎可以忽略不计，即最初的二十几个小时内药物的迅速释放是由于腙键的断裂而不是聚合物的降解。细胞存活实验显示Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP能够明显地降低A2780人卵巢癌细胞的细胞存活率，并且其所共轭顺铂药物量只相当于7 μmol·L－1游离顺铂药物，却可以达到与50 μmol·L－1游离顺铂药物的细胞毒性的效果，证实了Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP对A2780人卵巢癌细胞具有较高的细胞毒性，且显著提高了顺铂的生物利用度。其机制主要为:采用纳米模式能将化疗药物在准确的时间递送至病变部位，并保证药物具有足够长的作用时间。更为重要的是肿瘤细胞膜上P糖蛋白的过表达可以阻止药物进入细胞，同时还能将部分进入细胞内的药物泵出，这是肿瘤耐药的重要机制[15]，而采用纳米封装技术的药物能够避开肿瘤细胞膜上高表达的跨膜蛋白(P糖蛋白)的识别，不仅可将药物分子靶向转运到特定的细胞或器官，还可递送细胞难以摄取的生物大分子药物(如核酸、蛋白质)至细胞内的活性部位，提高了治疗的效率[16]。

综上所述，本研究合成的新型酸响应Bi(PEGPLA)-Pt(IV)聚合物-顺铂前体药物共轭NP可以作为一种新的顺铂药物递送载体，具有良好的酸响应释放动力学表现，能够增强对癌症细胞的细胞毒性作用。同时增强药物靶向性，降低对其他组织细胞的毒副作用。与国内外文献报道的繁琐的屏蔽-去屏蔽保护方法相比，更具有可行性。这种新型酸响应Bi(PEGPLA)-Pt(IV)聚合物-顺铂前体药物共轭NP有望成为更优良的抗肿瘤制剂，为新型功能化药物运载系统的研究奠定基础。

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