赵玉苗，孙文聪，张景亮，王丽雯，刘 华，程晓丽#

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州 450001 2)郑州大学临床医学系 郑州 450052 3)郑州华信学院护理系基础教研室 郑州 451150 4)郑州大学第三附属医院生殖医学中心 450052

两个汉族少汗型外胚层发育不良家系患者EDA基因突变检测*

赵玉苗1，2)，孙文聪1，2)，张景亮1，3)，王丽雯1，4)，刘 华1)，程晓丽1)#

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州 450001 2)郑州大学临床医学系 郑州 450052 3)郑州华信学院护理系基础教研室 郑州 451150 4)郑州大学第三附属医院生殖医学中心 450052

#通讯作者，女，1963年4月生，副教授，研究方向：遗传病的分子机制与诊断，E-mail：chengxiaoli@zzu.edu.cn

少汗型外胚层发育不良；EDA基因；突变

目的：检测两个汉族少汗型外胚层发育不良家系患者少汗型外胚层发育不良基因(EDA)1、3、5、8、9外显子的突变情况。方法从两个家系共16名成员中抽取7名成员，A家系4名、B家系3名。提取7人外周血全基因组的DNA，采用聚合酶链反应扩增目的基因后直接进行DNA序列测定，使用BLAST软件对测序结果进行比对分析，检测突变。结果3、5、8外显子上存在G740A、G904A和A1165G点突变，1、8、9外显子上出现5种移码突变；家系A和家系B均有患者发生33delC移码突变和G904A点突变，且这两种突变在两个家系上下代之间传递。结论少汗型外胚层发育不良的突变基因有很大异质性。33delC、G904A突变可能与少汗型外胚层发育不良的发生有关，33delC和G904A突变对两家系再发风险的预测具有一定的临床意义。

X连锁隐性遗传型少汗型外胚层发育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia，HED)又被称为1型外胚层发育不良或Christ-Siemens-Touraine综合征，是一种以汗腺、毛发、牙齿等外胚层组织发育不全或形态缺陷及免疫力低下为主要特征的罕见先天性遗传病，符合在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM：#305100)中X连锁HED的典型临床表现。新生儿发病率约为1:1 000 000[1]，其基因(ectodysplasin A，EDA)定位于Xq12-13.1，有9个外显子，编码391个氨基酸。已公布的与发病相关的各种EDA基因突变种类逾100种[2]。EDA基因存在较大的异质性和种族差异[3]。据Canueto等[2-5]报道，95%的突变都发生在1、3、5、8、9外显子。该研究中作者检测了两个汉族HED家系患者及亲属EDA基因在1、3、5、8、9外显子的突变类型，以期丰富EDA基因分子数据库，为开展HED胎儿产前诊断及新生儿病早期临床分子诊断等服务。

1 对象与方法

1.1研究对象HED家系A和家系B均为汉族，来自河北邯郸相邻的农村。两家系系谱图见图1(箭头标注者为先证者)，患者均为男性。两先证者(郑州大学第一附属医院皮肤科门诊患者)临床症状相似，先天性数颗牙齿缺失、毛发稀少、皮肤干燥，左前臂腹侧行毛果芸香碱发汗试验未见蓝色斑点(发汗试验阴性)，皮肤组织病理检测示汗腺密度明显下降、皮脂腺极少，智力发育正常。其他患者与两先证者临床症状相似。所有患者符合在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM：#305100)中X连锁HED的典型临床表现。经知情同意后，采集到家系A中Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅲ3、Ⅲ4，家系B中Ⅰ2、Ⅱ1和Ⅱ2外周静脉血各5 mL，EDTA抗凝。采用以往研究中保留的健康个体血样DNA作对照。

1.2DNA提取经典酚/氯仿法[4]提取DNA，灭菌双蒸水稀释，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3PCR扩增引物设计参考文献[3]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。各外显子退火温度、扩增片段长度见表1。PCR总反应体系20 μL：100 ng DNA，10 μL 2×Taq MasterMix，1 μL上、下游引物(500 nmol/L)，8 μL ddH2O。PCR循环参数[3]：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火45 s，72 ℃延伸45 s，共45个循环；最后72 ℃延伸8 min。产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，电泳时间0.5～1.0 h，电压100 V，紫外线成像仪检测结果，照相记录。

1.4测序与数据分析将扩增产物送北京百泰克生物技术有限公司测序，用Chromas软件读取测序结果，Clustal X 软件进行多重序列比对。应用美国国立生物技术信息中心的BLAST软件与Gene数据库公布的人类EDA基因核苷酸序列(Gene ID 1 896)进行比对分析。

图1 A、B两HED家系系谱图

表1 EDA基因各外显子引物

2 结果

2.1PCR产物电泳结果EDA基因外显子1、3、5、8、9 PCR扩增产物见图2。

图2 外显子1、3、5、8、9的扩增结果

M：Maker；1：外显子9；2：外显子5；3、5：外显子3；4：外显子8；6：外显子1；7：对照。

2.2基因突变检测结果患者和家系其他成员的外显子3、5、8上存在G740A、G904A和A1165G点突变；1、8、9外显子上出现5种移码突变(表2)。第5外显子的904位碱基G→A与第9外显子 1511 位碱基C插入见图3(箭头示突变位点)，这两个位点与Gene数据库公布的人类EDA基因核苷酸序列(Gene ID 1 896)进行比对分析，结果见图4、5。33delC和G904A突变在两个家系上下代之间都存在。

表2 患者和家系其他成员各外显子突变结果

*:新发突变；ins：插入突变；del：缺失突变。

图3 外显子5的904 位碱基G→A突变峰值图(左)和外显子的1511位碱基插入峰值图(右)

图4 外显子5 部分核苷酸序列比对结果

Query：患者外显子5部分序列；Sbjct：NCBI 正常人核苷酸标准序列(Gene ID 1 896)；箭头示外显子5的904 位碱基G→A突变。

图5 外显子9 部分核苷酸序列比对结果

Query：患者外显子9部分序列；Sbjct：NCBI 正常人核苷酸标准序列(Gene ID 1 896)；箭头示外显子9的1511位插入1个碱基G。

3 讨论

EDA基因主要在外胚层中特定的与角质、毛囊、汗腺等起源相关的细胞中表达，其编码的蛋白含有391个氨基酸，为Ⅱ型三聚体单次跨膜蛋白，具有1个大的细胞外结构域、1个单一跨膜结构域和1个短小的细胞内结构域，其胞外区含胶原结构域(Gly-X-Y)19和肿瘤坏死因子结构域。肿瘤坏死因子结构域片段内的突变将会影响EDA与受体的特异性结合，可导致正常外胚层上皮细胞信号通路中断，对皮肤及其附属物的正常发育产生严重影响[6-7]。

外显子5的904位点G→A突变是两家系患者均存在的突变；该位点位于EDA蛋白胞外区胶原结构域，该突变导致密码子由GGT变为GAT，可使蛋白多肽链第302位甘氨酸变为天冬氨酸。甘氨酸为水溶性氨基酸，天冬氨酸则为酸性。氨基酸性质的转变可能影响肽链胞外区电荷的性质，继而影响EDA与受体的特异性结合、外胚层上皮细胞信号的传递等功能。推测该位点突变可能与外胚层发育有一定关系。

Hashiguchi等[8]对8个不相关的日本EDA家系外显子1的研究发现存在31delC突变；该突变可引起框移和终止密码子的提前出现。该研究结果显示A、B两家系患者EDA基因外显子1上均存在33delC突变。1号外显子33位点位于多肽链N端，属于胞内结构域，是EDA及其受体结合后激活核转录因子-κB信号通路的关键区域，该通路对细胞信息的转录调控起核心作用，在EDA蛋白的二级结构中发挥着关键作用。

值得注意的是两个家系中表型正常的AⅡ2、AⅢ4和BⅠ2也被检出存在外显子1 33delC和外显子5 G904A突变，可以推定患者AⅢ3的33delC和G904A突变来自表型正常的AⅡ2；BⅡ1、BⅡ2的33delC和G904A突变来自表型正常的BⅠ2，即这两个突变在这两个家系的上下代之间传递，这对临床预测该病是否再发具有一定的诊断意义，特别是A家系中的Ⅲ1和Ⅲ4婚育时以及B家系中Ⅰ2再生育时有必要进行相关遗传咨询与分子水平的基因诊断。此外，A1165G、G740A、520delCTC、1163del GAAGTA、1425insC、1511insG等突变的出现提示诱发HED的突变基因有很大异质性。异质性的存在增添、加大了建立一个适合较大人群的HED分子诊断标准的难度，因此HED的相关分子生物学研究尚需深入进行。

[1]Liu Y，Yu X，Wang L，et al.Mutation p.Leu354Pro in EDA causes severe hypohidrotic ectodermal dysplasia in a Chinese family[J].Gene，2012，491(2)：246

[2]Canueto J，Zafra-Coboa MI，Ciria S，et al.A novel EDA gene mutation in a Spanish family with X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia[J].Actas Dermosifiliogr,2011，102(9)：722

[3]陈建军，杨森，宋映雪，等.X性连锁少汗性外胚层发育不良家系ED1基因突变检测[J].中华皮肤科杂志，2003，36(10)：553

[4]Tong DX，He SP，Wang LW，et al.Association of single- nucleotide polymorphisms in the cannabinoid receptor 2 gene with schizophrenia in the Han Chinese population[J].J Mol Neurosci，2013，51(2)：454

[5]Zhang J，Han D，Song SJ，et al.Correlation between the phenotypes and genotypes of X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia and non-syndromic hypodontia caused by ectodysplasin-A mutations[J].Eur J Med Genet，2011，54(4)：e377

[6]雷科，何祥一.少汗型外胚层发育不良症相关基因及其蛋白[J].国际口腔医学杂志，2009，36(1)：120

[7]Fan HL，Ye XQ，Shi L,et al.Mutations in the EDA gene are responsible for X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia and hypodontia in Chinese kindreds[J].Eur J Oral Sci，2008,116(5)：412

[8]Hashiguchi T，Yotsumoto S，Kanzaki T.Mutations in the ED1 gene in Japanese families with X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia[J].Exp Dermatol，2003,12(4)：518

(2013-12-24收稿 责任编辑徐春燕)

Mutation detection of EDA gene in two Han pedigrees with hypohidrotic ectodermal dysplasia

ZHAOYumiao1，2)，SUNWencong1，2)，ZHANGJingliang1，3)，WANGLiwen1，4)，LIUHua1)，CHENGXiaoli1)

1)DepartmentofCellBiologyandMedicalGenetics，CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001 2)DepartmentofClinicalMedicine，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

3)BasicTeachingandResearchingSection,DepartmentofNursing，ZhengzhouHuaxinUniversity，Zhengzhou451150 4)CenterforReproductiveMedicine，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

hypohidrotic ectodermal dysplasia；EDA gene；mutation

Aim：To detect mutations in ectodysplasin A(EDA) gene in two pedigrees with hypohidrotic ectodermal dysplasia(HED).Methods：Seven from 2 pedigrees(16 family members in total) were chosen,among which,4 were from pedigree A,and 3 were from pedigree B.The peripheral blood samples were collected and DNA was extracted.The fragments of exons 1,3,5,8,and 9 were amplified using PCR,the PCR products were sequenced and the results were analyzed by BLAST.Results：There were mutations of G740A,G904A and A1165G in exons 3,5,and 8,and 5 kinds of frameshift mutations in exons 1,8,and 9.33delC and G904A were found in pedigree A and pedigree B,and both mutations could be passed down between generations.Conclusion：33delC and G904A mutations may be associated with HED.33delC and G904A mutations may have some clinical significance in predicting the risk of recurrence of HED.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.05.029

*郑州大学大学生创新实验项目资助课题 2009CXSY002

R715.5