王富霞，夏熙郑，刘待见

郑州大学第二附属医院呼吸内科 郑州 450014

慢性阻塞性肺疾病模型大鼠骨骼肌组织中Caspase-12和m-Calpain的表达

王富霞，夏熙郑#，刘待见

郑州大学第二附属医院呼吸内科 郑州 450014

#通讯作者，男，1955年12月生，本科，教授，研究方向：慢性阻塞性肺疾病和呼吸系统感染性疾病，E-mail：xiaxizheng@126.com

慢性阻塞性肺疾病；骨骼肌萎缩；Caspase-12；m-Calpain；细胞凋亡；大鼠

目的：探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠骨骼肌组织中Caspase-12和m-Calpain的表达情况。方法将40只健康雄性Wistar大鼠随机分为COPD模型组和对照组各20只，模型组采用反复熏香烟加气道内滴猪胰弹性蛋白酶法建立COPD模型。采用TUNEL法测定2组大鼠骨骼肌(膈肌、趾长伸肌)细胞凋亡率，采用免疫组化法、RT-PCR检测2组大鼠骨骼肌内Caspase-12和m-Calpain蛋白及mRNA的表达。结果与对照组相比，模型组大鼠膈肌、趾长伸肌的凋亡率增加(t=23.190和28.184，P<0.001)，Caspase-12和 m-Calpain 蛋白和mRNA的表达亦增强(P<0.001)。模型组大鼠膈肌、趾长伸肌中Caspase-12和m-Calpain 蛋白与mRNA的表达有关(r=0.885和0.787，P<0.05；r=0.862和0.774，P<0.05)。结论Caspase-12可能参与 COPD 大鼠骨骼肌萎缩，m-Calpain可能通过激活 Caspase-12 参与该过程。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以气流受限为特征的肺部疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，有较高的致死率和致残率[1]，常伴有不明原因的骨骼肌萎缩[2]，严重的骨骼肌萎缩降低了患者的锻炼耐受力和生活质量。有研究[3]发现COPD模型大鼠骨骼肌细胞凋亡过程中Caspase-8和Caspase-9 明显表达；内质网凋亡途径中的Caspase-12是否参与COPD大鼠骨骼肌的萎缩过程，目前国内未见报道。作者检测了COPD模型大鼠骨骼肌中Caspase-12及m-Calpain蛋白和mRNA的表达，探讨其在COPD大鼠骨骼肌萎缩中的意义。

1 材料与方法

1.1实验材料红旗渠牌香烟(河南中烟安阳卷烟厂，尼古丁1.0 mg/支，焦油12 mg/支)，猪胰弹性蛋白酶(Sigma公司分装，上海森雄科技实业有限公司代理)，原位细胞凋亡TUNEL检测试剂盒(法国罗氏公司)，Caspase-12及m-Calpain抗体(上海晶天生物科技有限公司)，逆转录试剂盒和 DNA Marker(Transgene公司)，Caspase-12免疫荧光试剂盒(北京中杉金桥生物工程技术有限公司)，小动物肺功能测定系统HX200型呼吸流量换能器(北京新行兴业科贸有限公司)，PCR仪(德国Eppendorf公司)，LOGENEPAS900病理图像分析系统(上海山富科学仪器有限公司)，采用大连竞迈生物电泳图像分析软件进行电泳条带扫描分析。

1.2实验动物分组及模型制备8～10周龄清洁级雄性Wistar大鼠40只(河南省实验动物中心)，体重(200±20) g，按随机数字表法分为对照组(20只)、模型组(20只)。动物适应性饲养1周后，模型组大鼠在第1～29天、第31～60天在自制密闭染毒箱内熏红旗渠牌香烟，2次/d，每次持续0.5 h，持续2个月，烟熏第30天，气管内注射入猪胰弹性蛋白酶200 U/kg)。对照组在模型组气管内注入猪胰弹性蛋白酶当天以相同术式气管内注入等体积注射用生理盐水，余不做任何干预。

1.3肺功能测定第60天，按陈涛等[4]描述的方法，随机在每组中选取10只大鼠测定第0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)、第0.3 秒用力呼气容积占用力呼气容积的百分比(FEV0.3/FVC)及最大呼气流速(PEF)：大鼠用水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后， 固定于鼠板， 纵向剪开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及胸骨舌骨肌，暴露气管，组织剪在气管软骨环之间水平剪破气管，插入Y形管，连接HX200型呼吸流量换能器，应用MS4000U-IC生物信号定量记录分析系统，经微机处理计算上述指标。

1.4组织标本采集剩余大鼠均在第61天用水合氯醛(3 mL/kg)腹腔内注射麻醉，行腹主动脉抽血处死，先快速分离右侧趾长伸肌，将其平均分为两部分，一部分放入DEPC预处理过的冻存管中，立即投入液氮罐中冻存，另一部分放入40 g/L多聚甲醛固定液中；再快速分离整个膈肌，左右剪开膈肌分成两部分，左侧放入DEPC预处理过的冻存管中，立即投入液氮罐中冻存，右侧放入40 g/L多聚甲醛固定液中。用40 g/L多聚甲醛液注入右心室灌注双肺至白色，取出肺组织，放入40 g/L多聚甲醛固定液中。

1.5 2组大鼠肺组织和骨骼肌病理学观察取出已固定24 h以上的肺组织和骨骼肌(膈肌和趾长伸肌)组织，石蜡包埋切片，苏木素-伊红染色后光学显微镜观察骨骼肌和肺组织病理改变。

1.6骨骼肌细胞凋亡率测定采用TUNEL技术测定，操作严格按试剂盒说明书进行。每张切片取5个不相关高倍视野进行细胞计数。凋亡细胞核呈黄色或棕黄色，正常细胞核呈蓝色。细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)×100%。

1.7 2组大鼠膈肌、趾长伸肌组织中Caspase-12和m-Calpain蛋白表达的测定采用免疫组化SP法。严格按各试剂盒说明书进行操作。每张切片取5个高倍视野，应用Biosens Digital Imaging System v1.6图像处理系统对Caspase-12和m-Calpain蛋白进行半定量分析，用积分光密度值进行分析。

1.8 2组大鼠膈肌、趾长伸肌组织中Caspase-12和m-CalpainmRNA表达的测定取一小块膈肌或趾长伸肌(约100 mg)至研钵内，加液氮研磨，加入1 mL Trizol试剂抽提RNA，RNA纯度及完整性检测和RT-PCR操作步骤均按照试剂盒说明书进行。Caspase-12上游引物序列5’-TCCTGGTCTTTATGTC CC-3’，下游引物序列5’-TATTCCATCTATGGCTCA-3’，扩增产物大小为261 bp；m-Calpain上游引物序列5’-ACCCAGCGACCTCTACCA-3’，下游引物序列5’-CCGTCCTCCATCTTGACC-3’，扩增产物大小为306 bp。GAPDH上游引物序列5’-CACGGCAAGT TCAACGGCACA-3’，下游引物序列5’-GCGGCATGT CAGATCCACAACG-3’，扩增产物大小为588 bp。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后，置于暗箱式紫外透射仪中成像，软件分析计算灰度值。

1.9统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用两独立样本t检验比较2组大鼠各项指标的差异，相关分析应用Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组大鼠一般情况模型组大鼠皮毛黄涩，活动减少，有明显的咳嗽、喘息、卧底弓背等呼吸困难的表现。对照组大鼠观察期内无异常表现。

2.2 2组大鼠肺组织、膈肌和趾长伸肌病理结果见图1。模型组大鼠支气管黏膜存在着不同程度的炎症改变，包括炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)增加，黏液腺增大，气道壁增厚，气道上皮的破坏，气道炎性渗出及肺气肿等表现。对照组大鼠膈肌肌纤维饱满，排列整齐，染色均匀，胞核位于肌膜下，排列规则，大小一致；模型组膈肌肌纤维萎缩，变细变薄，染色不均匀，部分可见崩解、断裂、坏死，炎性细胞浸润，结构排列紊乱、松弛，细胞核排列不规则，大小不一。对照组大鼠趾长伸肌肌纤维结构正常，排列整齐，横纹清晰可见，多个细胞核呈扁椭圆形分布在胞质周边；模型组大鼠趾长伸肌肌纤维排列疏松，细胞核大小不一，骨骼肌纤维有变性、断裂，横纹消失，可见炎性细胞浸润，提示骨骼肌纤维出现萎缩现象。

图1 2组大鼠肺组织、膈肌和趾长伸肌病理结果(HE,×200)

2.3 2组大鼠肺功能检测见表1。

表1 2组大鼠肺功能的比较

2.4 2组大鼠膈肌、趾长伸肌细胞凋亡率测定见表2、图2。模型组大鼠膈肌、趾长伸肌细胞凋亡率高于对照组。

2.5 2组大鼠膈肌、趾长伸肌组织内Caspase-12和m-Calpain蛋白的表达见表3。模型组大鼠膈肌、趾长伸肌组织内Caspase-12和m-Calpain蛋白的表达均高于对照组。

表2 2组大鼠膈肌、趾长伸肌细胞凋亡率比较 %

图2 2组大鼠大鼠膈肌、趾长伸肌细胞凋亡比较(SP，×400)

表3 2组大鼠膈肌、趾长伸肌组织内Caspase-12和m-Calpain蛋白的表达

2.6 2组大鼠膈肌、趾长伸肌组织内Caspase-12和m-CalpainmRNA的表达见图3、表4。

图3 2组大鼠膈肌(上)、趾长伸肌(下)组织内Caspase-12和m-Calpain mRNA的表达

表4 2组大鼠膈肌、趾长伸肌组织内Caspase-12和m-Calpain mRNA表达的比较

2.7相关性分析模型组大鼠膈肌中m-Calpain和Caspase-12蛋白与mRNA的表达呈正相关(r=0.885和0.787，P<0.05)，趾长伸肌中m-Calpain和Caspase-12蛋白与mRNA的表达也呈正相关(r=0.862和0.774，P<0.05)。

3 讨论

有研究[3]报道COPD患者发生骨骼肌萎缩的可达20%～40%。最近的研究[5]表明，细胞凋亡在骨骼肌萎缩中扮演重要角色，骨骼肌细胞凋亡增加导致肌肉纤维数量减少，从而引起COPD患者骨骼肌萎缩和体重减轻。有实验[6]发现许多原因引起的骨骼肌萎缩中都伴有细胞凋亡的增加。该研究中HE染色显示COPD模型组大鼠膈肌和趾长伸肌组织骨骼肌纤维均出现萎缩现象。

细胞凋亡信号传导途径包括研究较早的死亡受体信号途径、线粒体路径及近年来发现的内质网途径，后者成为当前的研究热点。内质网是真核细胞中一种特有的亚细胞器。当环境毒物、缺氧、病毒等因素刺激时内质网出现腔内错误折叠、未折叠蛋白聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态，引起内质网应激。内质网应激可促使内质网发生一系列生理变化，对蓄积在网腔内的错误折叠或未折叠蛋白质进行处理，有利于维持细胞的正常功能并使之存活，但过度的内质网应激可引起细胞凋亡[7]。Caspase-12存在于内质网，在内质网应激诱导凋亡过程中起重要的作用[8-9]。正常情况下Caspases-12以非活性的半胱氨酸酶原形式存在，过度的内质网应激可激活Caspase-12，然后激活促凋亡的Caspase-9，进而激活凋亡的执行分子Caspase-3，最终引起细胞凋亡。Kalai等[10]研究证明Caspase-12主要在肺部和骨骼肌表达。有研究[11]显示Caspase-12在吸烟致COPD大鼠模型肺泡上皮细胞中表达增加，即吸烟能够导致肺泡上皮细胞发生内质网应激诱导性凋亡。也有研究[12]显示内质网应激途径在老年大鼠骨骼肌萎缩中起重要作用。该实验显示，与对照组比较，COPD模型组大鼠膈肌与趾长伸肌中细胞凋亡率、Caspase-12蛋白及mRNA的表达水平明显提高，提示Caspase-12可能参与模型组骨骼肌细胞凋亡。

钙蛋白酶家族中最具特点的是m-Calpain和μ-Calpain。内质网是细胞内存放Ca2+的重要容器，当细胞损伤时，内质网储存钙的能力失衡，引发Ca2+大量释放而激活钙蛋白酶，被激活的钙蛋白酶从细胞液转移至膜系统发挥蛋白水解作用，将ProCaspase-12切割成Caspase-12，最后激活它[13]，引起一系列细胞凋亡。钙蛋白酶激活途径与很多疾病的形成有关，如缺血性脑损伤、阿尔茨海默病等[14]，钙蛋白酶之所以能发挥这些作用，很大原因是因为激活了Caspase-12。该研究结果显示COPD模型组大鼠骨骼肌中的m-Calpain蛋白及mRNA表达水平显著提高，且与Caspase-12有关，提示m-Calpain可能通过激活Caspase-12促进细胞凋亡的发生，从而参与骨骼肌萎缩的过程。

总之，细胞凋亡是COPD机制研究中的热点之一，而内质网应激参与了COPD的发生发展[15]。该研究表明，Caspase-12介导的内质网凋亡途径可能参与COPD大鼠骨骼肌萎缩过程，m-Calpain可能通过激活Caspase-12而参与其中，但具体机制不明确，有待进一步研究。

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(2013-09-22收稿 责任编辑赵秋民)

Expression of Caspase-12 and m-Calpain in rat skeletal muscle in the COPD model

WANGFuxia，XIAXizheng，LIUDaijian

DepartmentofRespiratoryDisease，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

chronic obstructive pulmonary disease；skeletal muscle atrophy；Caspase-12；m-Calpain；cell apoptosis；rat

Aim: To study the expression and significance of Caspase-12 and m-Calpain in COPD rats skeletal muscle atrophy.Methods:A total of 40 healthy male Wistar rats were randomly divided into model group(n=20) and control group(n=20). COPD model rats were copied by tabocco smoke inhalation and intracheally given PEE successfully.Skeletal muscle apoptosis rate was evaluated by TUNEL method.The expression of Caspase-12 and m-Calpain mRNA and protein in rat skeletal muscle were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical respectively．Results: Compared with control group,the rates of muscle apoptosis in both diaphragmatic muscle and long extensor muscle digits of the model group were increased(t=23.190，28.184；P<0.001),and the expression of Caspase-12 and m-Calpain protein and mRNA were significantly enhanced (P<0.001).Caspase-12 and m-Calpain had significant correlation(r=0.885，0.787，P<0.05；r=0.862，0.774，P<0.05).Conclusion: Reticulum apoptosis pathway, which involving Caspase-12 and m-Calpain, may be responsible for COPD rats skeletal muscle atrophy.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.018

R562