王凤伟，牛光明，张鹏远，陶胜忠

郑州大学第二附属医院神经外科 郑州 450014

脑胶质瘤组织中Beclin-1的表达及与预后的关系*

王凤伟，牛光明，张鹏远，陶胜忠#

郑州大学第二附属医院神经外科 郑州 450014

#通讯作者，男，1968年10月生，博士，主任医师，研究方向：脑胶质瘤的基础与临床，E-mail：tao2000zz@163.com

胶质瘤；Beclin-1；预后

目的：探讨人脑胶质瘤组织中自噬相关基因Beclin-1的表达及与预后的关系。方法采用免疫组化SP法及RT-PCR技术检测43例脑胶质瘤组织(包括Ⅰ级5例，Ⅱ级17例，Ⅲ级12例，Ⅳ级9例)及11例非瘤脑组织中Beclin-1蛋白和mRNA的表达，同时对随访资料进行Kaplan-Meier生存分析。结果非瘤脑组织，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白和mRNA的表达水平差异均有统计学意义(F=99.962和41.951，P均<0.001)。Ⅲ级、Ⅳ级脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白和mRNA的表达水平低于Ⅰ级、Ⅱ级脑胶质瘤组织和非瘤脑组织(P<0.05)，Ⅰ级、Ⅱ级脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白的表达水平低于非瘤脑组织(P<0.05)。43例患者随访到35例，以脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白表达水平的中位数为界限，将35例患者分成Beclin-1蛋白低表达组(16例)及高表达组(19例)，两组的Kaplan-Meier生存曲线差异有统计学意义(χ2=4.962，P=0.026)，Beclin-1蛋白高表达组预后优于低表达组。结论Beclin-1可作为判断人脑胶质瘤预后的新指标用于临床。

脑胶质瘤是来源于神经上皮的、颅内最常见的恶性肿瘤，占颅内肿瘤的40%～50%，该肿瘤多呈浸润性生长，手术不易全切，治疗效果差。近些年寻找新的脑胶质瘤治疗靶点成为重要的研究方向。自噬相关基因Beclin-1是酵母ATG6基因在哺乳动物中的同源物,是第一个被确认的自噬通路上的肿瘤抑制因子[1]。自噬通路中自噬相关基因的缺失在肿瘤发生及恶性演进过程中起着重要作用。据相关文献[2-3]报道，自噬通路中Beclin-1基因的转录水平与脑胶质瘤的增殖与恶性转化关系密切。作者分析了不同病理级别脑胶质瘤组织中Beclin-1的表达,并探讨了其表达与患者预后的关系,进一步为脑胶质瘤的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1标本来源收集郑州大学第二附属医院神经外科2009年7月至2011年8月手术切除的新鲜脑胶质瘤标本43例，标本均经病理确诊,离体后0.5 h内转至-80 ℃深低温冰箱冻存。患者均为初发病例，术前未接受放、化疗等治疗，其中男23例，女20例，年龄6～69(39.7±18.2)岁；星形胶质细胞瘤27例，少突胶质细胞瘤4例，室管膜细胞瘤5例，髓母细胞瘤4例，多形性胶质母细胞瘤2例，胶质肉瘤1例；按照2007年WHO神经肿瘤分类标准进行病理分级，其中Ⅰ级5例，Ⅱ级17例，Ⅲ级12例，Ⅳ级9例。另取11例来自同期收治的脑外伤或脑出血患者的非瘤脑组织标本作为对照，患者男7例，女4例，年龄(31.4±13.8)岁。手术切除后标本分成两部分，一部分用于Beclin-1 mRNA的检测，另一部分用于Beclin-1蛋白的检测。

1.2主要试剂Beclin-1一抗、兔抗羊免疫荧光IgG二抗均购于美国Santa Cruz公司，逆转录PCR试剂盒(TaKaRa公司)和RNA试剂盒(包括Taq酶)购于北京赛百盛基因技术有限公司，Beclin-1 PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白的检测采用免疫组化SP二步法。冰冻组织常规制片，滴加用PBS稀释100倍的Beclin-1一抗，然后滴加生物素化二抗工作液。染色严格按照说明书进行操作。以已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。Beclin-1蛋白阳性信号定位于细胞质。利用Gel-Pro Analyzer 6.0图像处理软件进行图像分析。每例切片在阳性反应区域选择5个200倍视野，计算染色区域累积光密度值与图片去除空白处的面积之比，取5个视野的平均值表示Beclin-1蛋白的表达水平。

1.4非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中Beclin-1mRNA的检测根据GenBank提供的相关序列，应用Primer 5.0软件自行设计PCR引物，并通过NCBI/Primer-BLAST网进行引物同源性比较。GAPDH引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’(上游)和5’-GCCAGTAGAGGCAGGGAT-3’(下游),目的片段大小628 bp。Beclin-1引物序列：5’-GGCACAAT CAATAACTTCA-3’(上游)和5’-TGTCTCGCCTTTCT CAAC-3’ (下游)，目的片段大小318 bp。取冻存标本1 mm3，剪碎研磨，加入1 mL Trizol溶液裂解，按Trizol试剂盒说明书采用一步法提取总RNA,按逆转录试剂盒说明合成cDNA。以cDNA为模板，进行PCR。PCR反应条件：94 ℃30 s，55 ℃35 s，72 ℃30 s，共30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像，利用Gel-Pro Analyzer 6.0软件进行图像分析，以目的条带与内参GAPDH条带累积光密度值的比值表示Beclin-1 mRNA的表达水平。

1.5预后分析采用门诊随访或通讯联系对43例患者进行术后随访，截止时间为2013年11月。总生存期的计算从患者第一次手术时间开始到随访截止日期为止，或因其他疾病、复发转移而死亡的日期为止，截尾值为0。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。不同组织中Beclin-1蛋白和mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析及LSD-t检验；分别对Beclin-1蛋白阳性及阴性表达患者绘制Kaplan-Meier生存曲线，并进行log-rank检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白和mRNA的表达见图1、2和表1。可以看出，脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白和mRNA的表达水平均低于非瘤脑组织。

图1 非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白的表达(SP，×200)

图2 非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中Beclin-1 mRNA的表达

表1 非瘤和脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白和mRNA表达水平的比较

*:与非瘤脑组织比较，P<0.05；#：与脑胶质瘤Ⅰ、Ⅱ级组织比较，P<0.05；△：与脑胶质瘤Ⅲ级组织比较，P<0.05。

2.2脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白的表达与患者术后生存情况的关系43例患者获随访35例。根据脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白表达水平的中位数0.036为界限，将35例患者分成Beclin-1蛋白低表达组(16例)及高表达组(19例)。分别对Beclin-1蛋白高及低表达患者绘制Kaplan-Meier生存曲线，见图3。经log-rank检验，两条生存曲线差异有统计学意义(χ2=4.962，P=0.026)，Beclin-1高表达组患者预后优于低表达组。

图3 生存曲线

3 讨论

Beclin-1是一个自噬相关基因，位于人染色体17q21，包括5’UTR 120 bp、1 353 bp的编码区序列及3’UTR 625 bp序列。近年来自噬相关基因与肿瘤的研究引起了广泛的关注，对于自噬相关基因在肿瘤中的表达及其在肿瘤演进中的作用，以及在不同肿瘤或同一器官不同类别肿瘤，甚至同一肿瘤的不同发展阶段的表达，各研究结果报道不一致。相关研究报道食管鳞状细胞癌[4]、胃癌[5]等肿瘤组织中Beclin-1的表达存在不同程度的降低，而肝癌[6]组织中却呈现Beclin-1高表达，而有关人脑胶质瘤组织中Beclin-1表达状况的相关研究罕见报道。Aita等[7]认为Beclin-1不仅参与自噬体的形成，诱导细胞凋亡，还可通过调节自噬活性在肿瘤演变过程中发挥重要作用。Niu等[8]发现应用RNA干扰及基因敲除技术使人类神经胶质瘤细胞株LN229、T98G和U251的Beclin-1基因沉默或表达缺失并没有促进细胞的增殖，反而诱导了细胞的自噬。马明明等[9]的研究结果表明，用神经节苷脂诱导恶性脑胶质瘤细胞U251 Beclin-1的表达上调导致细胞株自噬的同时，细胞增殖明显受到抑制。上述相关研究提示，Beclin-1是一种具有双重作用的自噬相关基因。

黄新等[10]分析了62 例不同病理级别的星形细胞瘤组织中Beclin-1的表达情况，结果显示星形细胞瘤组织中Beclin-1蛋白表达随肿瘤病理级别的升高而降低，生存期大于36个月者Beclin-1表达水平高于生存期小于36个月者。该研究发现，脑胶质瘤组织中Beclin-1蛋白和mRNA表达水平均低于非瘤脑组织，并且随胶质瘤细胞分化程度的降低(病理级别的升高)而逐渐下降，表明Beclin-1基因表达下调可能是脑细胞发生恶性转化的原因之一。同时，作者还发现Beclin-1蛋白高表达组预后优于低表达组，提示Beclin-1可作为脑胶质瘤预后判断的辅助指标用于临床。

总之，作者认为，检测脑胶质瘤组织中Beclin-1的表达可能对脑胶质瘤恶性程度及预后的判断有一定的指导意义。

[1]Yue Z,Jin S,Yang C,et al.Beclin 1, an autophagy gene essential for early embryonic development, is a haploinsufficient tumor suppressor[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(25):15077

[2]Huang X,Bai HM,Chen L,et al.Reduced expression of LC3B-Ⅱ and Beclin 1 in glioblastoma multiforme indicates a down-regulated autophagic capacity that relates to the progression of astrocytic tumors[J].J Clin Neurosci,2010,17(12):1515

[3]Cao Y,Klionsky DJ.Physiological functions of Atg6/Beclin 1: a unique autophagy-related protein[J].Cell Res,2007,17(10):839

[4]单国用,刘兴安,张松,等.食管鳞状细胞癌组织中自噬基因Beclin 1蛋白的表达[J].郑州大学学报:医学版,2010,45(3):366

[5]郭长青,邵经浩,卢瑞利,等.胃癌组织中Beclin 1和PTEN蛋白的表达[J].郑州大学学报:医学版,2010,45(3):463

[6]Tang H,Da L,Mao Y,et al.Hepatitis B virus X protein sensitizes cells to starvation-induced autophagy via up-regulation of beclin 1 expression[J].Hepatology,2009,49(1):60

[7]Aita VM,Liang XH,Murty VV,et al.Cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21[J].Genomics,1999,59(1):59

[8]Niu TK,Cheng Y,Ren X,et al.Interaction of Beclin 1 with survivin regulates sensitivity of human glioma cells to TRAIL-induced apoptosis[J].FEBS Lett,2010,584(16):3519

[9]马明明,王雪晶,丁雪冰,等.神经节苷脂诱导胶质瘤细胞自噬性死亡[J].肿瘤基础与临床,2012,25(4):281

[10]黄新,白红民,陈亮,等.自噬相关基因Beclin 1在星形细胞瘤中的表达及意义[J].中国微侵袭神经外科杂志,2009,14(12):559

(2013-11-07收稿 责任编辑王 曼)

Expression of Beclin-1 in human glioma tissue and its relationship with the prognosis

WANGFengwei，NIUGuangming，ZHANGPengyuan，TAOShengzhong

DepartmentofNeurosurgery，theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

glioma；Beclin-1；prognosis

Aim: To explore the relationship between the prognosis and the expression of autophagy-related gene Beclin-1 in human glioma tissue. Methods: Immunohistochemistry and RT-PCR technology were used to detect the expressions of Beclin-1 protein and mRNA in 43 cases of glioma tissue(including 5 cases of grade Ⅰ,17 cases of grade Ⅱ,12 cases of grade Ⅲ and 9 cases of grade Ⅳ)and 11 cases of non-tumor brain tissue. The follow-up data were analyzed by Kaplan-Meier survival analysis. Results: There were significant differences in the expressions of Beclin-1 protein and mRNA among non-tumor brain tissue, grade Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ glioma tissue(F=99.962 and 41.951，P<0.001).The expressions of Beclin-1 protein and mRNA in grade Ⅲ and grade Ⅳ glioma tissue were lower than those in grade Ⅰ,grade Ⅱglioma tissue and non-tumor brain tissue(P<0.05). The expression of Beclin-1 protein in grade Ⅰ and grade Ⅱglioma tissue was lower than that in non-tumor brain tissue(P<0.05).A total of 35 out of the 43 cases were followed up, 16 cases with low expression of Beclin-1 protein and 19 with high expression based on the median expression level.The Kaplan-Meier survival curves of the 2 groups differed from each other(χ2=4.962，P=0.026), and the prognosis of high expression of Beclin-1 protein group was better than that of the low expression group. Conclusion: Beclin-1 may be a new indicator to predict the prognosis of human glioma.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.008

*河南省卫生科技创新型人才工程资助项目 201004126

R739.41