刘丽星 朱陵群 黄希艳 李 倩 邹忆怀

(北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室，北京 100700)

片仔癀对局灶性脑梗死大鼠肿瘤坏死因子-α、细胞间黏附分子-1及血管细胞黏附分子-1含量的影响※

刘丽星 朱陵群△黄希艳 李 倩 邹忆怀1

(北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室，北京 100700)

目的观察片仔癀对局灶性脑梗死大鼠炎性损伤相关因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)含量的影响。方法将74只SD标准性大鼠随机分成7组，即假手术组10只，按照改良的EZ Longa法制备大脑中动脉栓塞大鼠模型64只，将手术后符合评分标准的大鼠分为模型组10只，片仔癀大剂量组10只、中剂量组12只、小剂量组10只，脑得生组和尼莫地平组各10只。造模前给药3d，造模后给药4d，处死取材，参照酶联免疫吸附法(ELISA)检测ICAM-1、VCAM-1及TNF-α的含量。结果模型组血清ICAM-1、VCAM-1及TNF-α含量较假手术组升高(P<0.01)；各给药组较模型组均有不同程度的降低，其中片仔癀大剂量组、脑得生组及尼莫地平组血清ICAM-1、VCAM-1、TNF-α含量较模型组降低(P<0.01)。结论片仔癀胶囊可以降低局灶性脑梗死后大鼠ICAM-1、VCAM-1及TNF-α的含量，对于神经功能具有保护作用。

疾病模型，动物；脑梗死；中药疗法；；肿瘤坏死因子α；胞间黏附分子1；血管细胞黏附分子1

急性缺血性脑梗死后炎症反应引发继发性损伤，研究表明，缺血性脑梗死后数小时肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌增加，持续维持在高水平，从而介导白细胞及大脑血管内皮细胞的激活，炎症相关黏附分子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的含量亦有明显升高，炎症反应有可能会增加梗死区的面积[1-2]。因此，抑制缺血性脑梗死后引发的一系列炎症反应具有重要意义。建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型，观察缺血性脑梗死后大鼠炎性损伤相关因子TNF-α及黏附分子ICAM-1、VCAM-1含量变化以及中药片仔癀对炎症相关因子及黏附分子含量的影响，探讨中药片仔癀在脑梗死后抑制脑细胞损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与实验药品 SD雄性大鼠74只，体质量(260±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2006-0009。片仔癀胶囊(主要成分为三七、麝香、牛黄、蛇胆，漳州片仔癀药业股份有限公司，国药准字09HA05，批号：0711050)；尼莫地平片(拜耳医药保健有限公司，国药准字H20003010，批号BJ00604，30mg/片)；脑得生(广东国医堂制药股份有限公司，国药准字Z35020243，批号110101)；尼龙栓线：型号2636，购自北京沙东生物技术有限公司；Rat TNF-α酶联免疫吸附法(ELISA)、Rat VCAM-1 ELISA、Rat ICAM-1 ELISA试剂盒均购自尚柏生物医学技术(北京)有限公司，货号RB 3R080、3R310s、3R110。

1.2 MCAO模型制备与分组 参照EZ Longa方法[3]，建立大鼠MCAO模型。术前12h禁食，腹腔注射麻醉(3.5%水合氯醛，10mL/kg)。从大鼠颈部正中切开皮肤，游离出颈总动脉、颈内动脉和外颈动脉，用无菌的手术线分别结扎颈外动脉近分叉处和颈总动脉近心端，用动脉夹夹闭颈内动脉，颈总动脉剪小口，将尼龙线栓插入颈内动脉中，遇阻力即停止，大约20mm，固定栓线，松开动脉夹和缝合皮肤。假手术组只进行颈部正中纵行剖开后缝合。大鼠清醒2h后，采用Longa EZ方法[1]进行评分：0分为神经功能正常；1 分为大鼠栓塞对侧前爪伸展不充分；2分为行走时向外侧打转；3分为行走时向对侧倾倒；4分为无法行走、意识丧失。将得分为1～3分的大鼠入组。将符合纳入标准的大鼠分为模型组、片仔癀小剂量组[0.0054g/(100g·d)]、片仔癀中剂量组[0.0162g/(100g·d)]、片仔癀大剂量组(0.048 6g/100g·d)、脑得生组[0.048 6g/(100g·d)]及尼莫地平组[0.001 08 g/(100g·d)]。造模前连续给药3d，第4d行MCAO手术，术后给药4d，于第7 d取材。给予模型组及假手术组等容积的0.9%氯化钠注射液。

1.3 取材及样品制备 于MCAO术后第4d取材，腹腔注射水合氯醛(3.5%)麻醉后，由腹主动脉采血，3000r/min低温离心10min后采集血清，取上清液分装于EP管中，-80℃冰箱冻存。采血后各组大鼠常规取脑组织，用4%多聚甲醛固定液固定24h，常规脱水、透明和石蜡包埋后进行石蜡切片，厚度为5μm。

1.4 病理学观察 常规伊红-苏木素(HE)染色：石蜡切片于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各15min，下行梯度酒精各5min，自来水洗20s，Harries苏木精1 min，自来水洗20s，盐酸酒精10s，自来水洗返蓝10s，伊红染色10min，自来水洗20s，85%酒精、95%酒精、100% 酒精各5s，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ透明各10min；用中性树胶封片后并于显微镜下观察。

1.5 ELISA法检测 将试剂盒放至室温，准备放映版，每孔中加入100μL标准品、100μL样本。加入50μL Anti-rat TNF-α Biotin或Anti-rat VCAM-1或Anti-rat ICAM-1 Biotin 轻轻混匀30s，封住板孔，室温温育3h。反复洗板3次。每孔加入100μL 1×HRP。轻轻混匀30s，封住板孔于室温放置30min。反复洗板3次。每孔各加入100μL TMB显色液后混匀10s，于暗处室温放置15min。每孔均加入100μL终止液混匀30s，在450nm处读吸光度值。横坐标为标准品浓度，纵坐标为吸光度值，绘制出标准曲线，以各孔的吸光度值计算出各样品的含量。

1.6 统计学方法 实验数据统计应用SPSS 18.0软件，组间两两进行比较，独立t检验。

2 结 果

2.1 病理学改变 模型组可见较大范围的坏死区，明显的软化灶，大小不等的空泡可见于坏死区，残存的神经细胞散在分布，部分神经细胞可见核固缩、深染、未见核仁，部分神经细胞可见核溶解、胞浆疏松，细胞界限模糊，水肿明显，嗜中性细胞见于坏死周边区；假手术组组织形态结构正常，神经细胞形态结构正常；片仔癀大、中剂量组的坏死区较模型组明显减小，其周围的神经细胞水肿较模型组明显减轻，胞浆和胞核尚清楚，部分大鼠的神经细胞形态结构接近假手术组；尼莫地平组及脑得生组的坏死区明显减小，一些小空泡不规则的仍可见于坏死区，其周围的部分神经细胞胞浆混浊，但胞核和核仁尚清楚，部分神经细胞的形态结构接近正常。

2.2 各组TNF-α、ICAM-1及VCAM-1含量比较 见表1。

组 别n剂量[g/(100g·d)]TNF-α含量ICAM-1含量VCAM-1含量假手术组10-6．559±1．8870．3828±0．0758143．8718±26．3506模型组10-17．283±3．078△1．1390±0．0949△427．7274±88．9551∗片仔癀小剂量组120．005411．796±3．621∗0．5200±0．0918∗∗235．0784±57．4947∗∗△片仔癀中剂量组120．016210．134±3．301∗0．5814±0．9935∗∗240．7234±55．8639∗∗△片仔癀大剂量组100．04869．957±1．157∗∗0．5896±0．0814∗∗244．7444±71．7801∗∗△脑得生组100．04869．517±1．248∗∗0．6928±0．1192∗∗319．0040±96．4820∗∗△尼莫地平组100．01088．272±1．733∗∗0．7023±0．1371∗∗322．8596±70．7252∗∗△

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.01

由表1可见，模型组TNF-α含量较假手术组显著升高(P<0.01)，片仔癀各剂量组、脑得生组及尼莫地平组TNF-α含量较模型组显著降低 (P<0.01)。各组MCAO大鼠血清中ICAM-1的含量，与假手术组比较，模型组显著增加(P<0.01)。片仔癀各剂量组、脑得生组及尼莫地平组ICAM-1含量较模型组显著降低(P<0.01)。片仔癀各组之间ICAM-1的含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组MCAO大鼠血清中VCAM-1的含量，与假手术组比较血清中VCAM-1含量均显著增加(P<0.01)。与模型组比较，片仔癀各剂量组、脑得生组及尼莫地平组VCAM-1的含量较模型组显著降低(P<0.01)，片仔癀各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

脑缺血缺氧后，引起能量代谢的异常，从而使神经细胞细胞膜电势发生变化，引发离子交换异常，细胞内Ca2+大量涌入，促进神经元或胶质细胞释放神经递质，如谷氨酸和(或)TNF-α，从而引发一系列的炎症反应，在引起脑损害的病理过程中以及继发性损伤中发挥了极其重要的作用[4]。脑缺血—再灌注后，TNF-α在损伤区域大量表达，吕建卫等[2]研究显示，脑梗死组患者TNF-α含量显著高于对照组，TNF-α的含量可能影响缺血灶的面积以及神经功能缺损程度。亦有实验研究表明，大鼠转TNF-α基因，使脑组织TNF-α的过度表达，使缺血性脑损伤明显加重[5]。

ICAM-1(CD54)在正常情况下很少表达，但在出现炎症损伤时可出现成倍的高表达[6]。ICAM-1可以与其配体淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)和巨噬细胞分化抗原-1(Mac-1)相结合发挥生物学效应[7]。ICAM-1可使白细胞流动变缓，使其与血管内皮细胞的黏附力增强，炎症细胞停留在浸润部位的时间延长等介导并增强炎症反应。VCAM-1(CD106)与整合素家族的极迟抗原-4(very late antigen-4，CD49d/CD29，α4β1)相结合发挥作用。VCAM-1主要表达于血管内皮细胞、巨噬细胞等部位，介导白细胞和血管内皮细胞的黏附、游走、渗出，并使该2种细胞停留于损伤区[8]。观察结果显示，模型组TNF-α、ICAM-1及VCAM-1的含量较假手术组明显升高(P<0.05)，提示TNF-α、ICAM-1及VCAM-1参与了脑梗死后神经病理损伤，给予片仔癀后可不同程度的下调TNF-α、ICAM-1及VCAM-1的含量(P<0.05)，提示其能减轻脑梗死后的炎症病理过程，从而对于神经功能具有保护作用。

局灶性脑梗死属中医学中风范畴。王永炎院士将中风的主要病机概括为“毒损脑络” 学说，即“脏腑功能亏虚，气血逆乱，邪盛毒成，毒损脑络”[9]。从而对中风发病机制有了更为全面的认识。片仔癀的中药成分主要有牛黄、三七、蛇胆、天然麝香等，具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛作用[10]，已广泛应用于急性、慢性肝炎，骨折和烧、烫等多种创伤，脓肿、无名肿毒及一切炎症引起的疼痛、发热等，均有较好的临床疗效，但在有关缺血性脑血管疾病方面的研究鲜有报道。本实验研究显示片仔癀使TNF-α、ICAM-1及VCAM-1的含量下降，提示片仔癀在抑制脑梗死后梗死区及周围的炎症反应方面的有效性，但有关其具体的作用机制尚需进一步探索。

[1] Tuttolomondo A，Pecoraro R，Di Raimondo D，et，al.Immune-inflammatory markers and arterial stiffness indexes in subjects with acute ischemic stroke with and without metabolic syndrome[J].Diabetol Metab Syndr，2014，6(1)：28.

[2] 吕建卫，邓文诚，李如辰.银杏叶片对急性脑梗死患者血浆ET-1、NO及TNF-α的影响[J].河北中医，2010，32(6)：901-903.

[3] Longa EZ，Weinstein PR，Carlsons S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[4] Watters O，O' Connor JJ.A role for tumor necrosis factor-α in ischemia and ischemic preconditioning[J].J Neuroinflammation，2011，(8)：87.

[5] Li YZ，Holtz ML，Kindym S，et al.Overexpression of murine TNF-αgene inc-reases infarct volume in focal cerebral ischemia stroke[J].Glia，2002，31：39-50.

[6] 李聪慧，叶建亚，门焕丽，等.SAH后迟发性脑血管痉挛中ICAM-1的表达变化及ICAM-1单克隆抗体和甲基强的松龙的防治作用[J].脑与神经疾病杂志，2010，18 (2)：97-100.

[7] Zimmerman T，Blanco FJ.Inhibitors targeting the LFA-1/ICAM-1 cell-adhesion interaction：design and mechanism of action[J].Curr Pharm Des，2008，14(22)：2128-2139.

[8] Ludewig P，Sedlacik J，Gelderblom M，et.al.Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke[J].Circ Res，2013，113(8)：1013-1022.

[9] 刘亚琼，朱陵群，王硕仁，等.中风病“毒损脑络”病机假说研究进展[J].北京中医药大学学报，2009，32(2)：98-100.

[10] 李倩，黄希艳，朱陵群.片仔癀对局灶性脑梗死大鼠水通道蛋白4(AQP4)表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2013，11(1)：59-61.

(本文编辑：董军杰)

EffectofPienTzeHuanontheamountofTNF-α,ICAM-1andVCAM-1offocalcerebralinfarctionrats

LIULixing,ZHULingqun,HUANGXiyan,etal.

KeyLaboratoryofChineseInternalMedicineofMinistryofEducationandBeijing，DongzhimengHospital，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100700

ObjectiveTo observe the effect of Pien Tze Huan on the serum amount of TNF-α, ICAM-1 and VCAM-1 after MCAO operation.MethodsMiddle cerebral artery occlusion (MCAO) rat model was established by improved EZ Longa method. 74healthy mature male SD rats were randomly divided into model group, sham operation group, small-dose, mid-dose, high-dose Pien Tze Huan group, positive control group 1 (nimodipine group) and positive control group 2( Naodesheng group). Rats were pretreated for 3days before modeling and administered for 4days after modeling, then were sacrificed. The amount changes of ICAM-1, VCAM-1and TNF-α were observed by methods of ELISA.ResultsThe amount of ICAM-1, VCAM-1 and TNF-αin the model group increased obviously after the MCAO operation compared with that in sham operation group (P<0. 01). The expression in each treatment group was lower than that in the model group (P<0. 05orP<0. 01).ConclusionPien Tze Huan can decrease the serum amount of ICAM-1, VCAM-1 and TNF-α so as to protect the nerve function.

Disease models; Animal; Cerebral infarction; Traditional Chinese medicine therapy; tumor necrosis factor α (TNF-α); Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1); Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)

※ 项目来源：国家科技重大专项项目(编号：2008ZX09202)

刘丽星(1986—)，女，博士研究生。研究方向：神经内科。

R-332；R743.31；R743.330.531；R743.330.25

A

1002-2619(2014)09-1382-03

2013-11-11)

△ 通讯作者：北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室，北京 100700

1 北京中医药大学东直门医院神经内科，北京 100700