李改仙，李建晴

（晋中学院化学化工学院，山西晋中030600）

日落黄褪色光度法检测H2O2-Fe(II)羟自由基

李改仙，李建晴*

（晋中学院化学化工学院，山西晋中030600）

利用Fenton反应中加色素日落黄（FCF），产生的羟自由基（·OH）氧化日落黄发生减色效应.加入抑制·OH的还原剂，测定日落黄吸光度的变化间接测定羟自由基的产生量.实验对抗坏血酸，盐酸羟胺在不同溶剂中的抗羟基自由基氧化性能进行了比较.结果表明：抗坏血酸、盐酸羟胺50%乙醇溶液的抗氧化能力较抗坏血酸、盐酸羟胺水溶液的抗氧化能力强.4种体系中的回收率分别为：抗坏血酸107.2%、盐酸羟胺50%乙醇溶液104.2%，抗坏血酸90.2%、盐酸羟胺水溶液96.0%.

微羟自由基；日落黄；H2O2-Fe（II）；EDTA-Fe（II）

随着人们对自由基研究的日渐深入，发现损害人体健康的自由基几乎都与活性氧自由基有关，它对人体的损害本质是一种氧化过程[1-3]，·OH氧化性强，易与蛋白、糖和氨基酸等进行反应，损伤细胞，引发各种疾病[4].对其的检测和抑制一直以来都受到人们的关注[5-8].文章利用Fenton反应中加色素日落黄（FCF），产生的羟自由基（·OH）氧化日落黄发生减色效应.加入抑制·OH的还原剂，测定日落黄吸光度的变化间接测定羟自由基的产生量.对抗坏血酸，盐酸羟胺在不同溶剂中的抗羟基自由基氧化性能进行了比较，为羟自由基（·OH）的检测，药剂的选择提供科学依据.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用有限责任公司）；HH-S恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器厂）；722s可见分光光度计（美国VARIAN公司）；pHS-2ST数显酸度计（上海天达仪器有限公司）；XS电子天平（瑞士普利赛斯）.

日落黄（天津多福源实业有限公司）：配制0.3mmlo/L的的溶液；H2O2（体积分数30%，使用时适当稀释）；3.8 mmol/L EDTA-Fe（II）溶液；三酸缓冲溶液；抗氧化剂溶液：抗坏血酸和盐酸羟胺分别配成1.0 mg/mL的溶液；所用试剂均为分析纯.

1.2 试验方法

10mL比色管中，顺次加3 mL三酸缓冲溶液（pH=2.00），3.8 mmol/L EDTA-Fe（II）溶液0.7mL，2.0 mL 0.3mmol/L日落黄标准溶液，0.6%H2O2溶液0.7 mL，蒸馏水定容且30℃水浴中恒温30 min，722S分光光度计上测λmɑx=480 nm处的吸光度A480.H2O2加入前FCF溶液的吸光度为A0，H2O2加入后的吸光度为Ab，吸光度的变化ΔA=A0-Ab来表示·OH的产生量.

在上面的实验环节中，H2O2加入之前先加入一定量的抗坏血酸、盐酸羟氨等还原剂，测定其吸光度As，抗羟自由基氧化率S的表观值计算公式为：

2 结果与讨论

2.1 实验条件的选择

2.1.1 日落黄的吸收光谱

按照实验方法作日落黄在加H2O2前后的吸收光谱见图1.结果表明，非氧化和氧化体系中，日落黄在λmɑx=480nm处都有最大吸收，但在加H2O2的日落黄体系的吸收（A）比未加的吸收程度要小.这表明羟自由基对日落黄具有较强的氧化褪色作用.

图1 日落黄的吸收光谱Fig.1Absorption Spectra

2.1.2 酸度的影响

配制pH为1.82、2.00、2.51、3.06、4.00、5.04、6.00、7.20、8.29、9.22、10.21和11.21的溶液，按2.1.1节方法测量各个不同酸度溶液的吸光度差值ΔA480，实验结果见图2.实验表明，在pH=2.00时，体系的ΔA480达最大值，故本实验选用pH为2.00的酸缓冲溶液.

2.1.3 日落黄用量的影响

合理的课程安排和教学方法是教师和学生为共同实现教学目标以及完成教学任务，在教学中所采取的教学手段和途径。合理的教学方法不再是单向的由教师向学生输出知识，学生接受知识，而是教师和学生相互联系的方法。教学观念的转变是教育改革的先导，先进的教学理念让学生首先通晓原理，能够超前反映教育未来发展的趋势和对未来人才的培养要求。我们培养人才的目标是要适应将来的需要，同时也为他们的未来着想。

实验测定了日落黄浓度对体系吸光度A480的影响.结果表明，随着日落黄溶液用量的增大，测定的ΔA480值也逐渐增大，而在日落黄的浓度达到0.09

图2 酸度的影响Fig.2The effect of acidity

mmol/L时，体系ΔA480值较大，并且A0，Ab处于测量误差较小范围.

2.1.4 H2O2用量的影响

依据实验方法改变加入H2O2的量，测其吸光度A480，测定结果见图3.结果表明，随着加入H2O2的量的增大，体系的ΔA480值也增大，可见Fenton反应产生产生的·OH量和体系中加入H2O2的量成正比.当加入H2O2的体积分数达到0.6%时，体系ΔA480达到最大，且A0，Ab的值也符合测量误差较小的要求，故选择加入0.6%的H2O20.7mL.

图3 H2O2用量的影响Fig.3The influence of the dosage of H2O2

2.1.5 EDTA-Fe（II）用量的影响

按2.1.1节方法加入不同体积3.8 mmol/L的EDTA-Fe（II）溶液，待完全反应，同样测吸光度A480，见图4.试验结果表明，随EDTA-Fe（II）加入量的增大，吸光度ΔA480值也是逐渐增大.当加入量达到0.7 mL时，体系ΔA480最大，其后达到饱和.本试验中，选EDTA-Fe（II）适宜用量为0.7mL.

2.1.6 反应时间的影响

图4 EDTA-Fe2+用量的影响Fig.4The influence of the dosage of EDTA-Fe2+

试验考察了体系的吸光度随反应时间的变化，试验表明，随着反应时间的延长，体系的ΔA480增长变小，说明：·OH氧化日落黄褪色速率减小.在30℃的温度下，反应的时间到30 min时，ΔA480增加就很小了.实验最佳反应时间定为30 min.

2.1.7 反应温度的影响

试验对反应体系的温度控制从25～45℃之间，测定了ΔA480.结果表明：随着温度的升高，体系的ΔA480逐渐增大，故试验选择的适宜反应温度定为30℃.

2.2 不同还原剂对羟自由基还原清除率的测定比较

按前述实验的方法，就还原剂抗坏血酸和盐酸羟胺两种试剂对·OH的还原清除能力进行了测定，实验结果见图5.

图5 抗氧化剂用量对抗羟自由基清除率的影响Fig.5Effect of the amount of antioxidants on the hydrox⁃yl radical scavenging rate

试验表明：抗坏血酸50%乙醇溶液对·OH的还原清除能力明显高于抗坏血酸水溶液，盐酸羟胺50%乙醇溶液对·OH的还原清除能力是高于盐酸羟胺的水溶液，即这两种还原剂的50%乙醇溶液对·OH的还原清除能力明显高于这两种还原剂的水溶液.且这两种还原剂（50%乙醇溶液和水溶液）对· OH的还原清除能力均与所加还原剂量有一定的比率关系，从实验数据可以看出，当还原剂加入量增大，·OH被还原清除率也随之增加，但当其用量增大到一定程度后还原·OH清除率（S）增大变慢或基本保持不变，即该还原剂对·OH被还原清除率基本达到饱和.

2.3 回收率实验

按照实验方法，在还原剂清除羟自由基没有达到饱和用量的区间作了抗坏血酸50%乙醇溶液、盐酸羟胺50%乙醇溶液、抗坏血酸水溶液和盐酸羟胺水溶液的标准回收率实验.表1所示为4次实验结果的平均值.

表1 回收率实验Tab.1Recovery results

结果表明：抗坏血酸、盐酸羟胺50%乙醇溶液的回收率大于其相应水溶液的回收率；无论在50%乙醇溶液中，还是在水溶液中，抗坏血酸的抗氧化能力较盐酸羟胺强.

3 结论

1）试验方法简单方便，快捷，所用实验设备简单，可以用来方便的测定羟自由基.

2）试验结果表明：抗坏血酸50%乙醇溶液>盐酸羟胺50%乙醇溶液>抗坏血酸水溶液>盐酸羟胺水溶液.这说明抗氧化剂用乙醇溶剂配置抗羟自由基氧化性能增强.

3）回收率实验结果，抗坏血酸、盐酸羟胺50%乙醇溶液的回收率分别为107.2%、104.2%，抗坏血酸、盐酸羟胺水溶液的回收率分别为90.2%，96.0%，回收率较高，结果较好.

[1]ABDI S,ALI A.Role of ROS modified human DNA in the pathogenesis and etiology of cancer[J].Cancer Letters,1999, 142(1)：1-9.

[2]Olsen H,Seljeflot I,Kahler H,et al.Increased leukocyte lev⁃els of reactive oxygen species(ROS)in populations at risk for atherosclerotic disease[J].Atherosclerosis,2000,151(1)：57-59.

[3]Angelopoulou R,Lavranos G,Manolakou P.ROS in the ag⁃ing male：Model diseases with ROS-related pathophysiology [J].Reproductive Toxicology,2009,2(28)：167-171.

[4]王允中.自由基与酶-基础理论及其在生理学和医学中的应用[M].北京：科学出版社,1989：193.

[5]文镜,刘璇,赵建.荧光法及化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用[J].中国酿造,2009(11)：130-133.

[6]杨芬,张瑞萍,贺玖明,等.羟自由基的产生、捕集及检测方法[J].药学学报,2007,42(7)：692-697.

[7]陈培榕,李景虹,邓勃.现代仪器分析试验与技术[M].北京：清华大学出版社,2006.

[8]丛建波,孙存普,莫简.自旋捕集短寿命自由基的低温保存[J].生物化学与生物物理进展,2003,20(4)：326-327.

责任编辑：毕和平

Fading Spectrophotometric Detection of Hydroxyl Free Radicals Produced in H2O2-Fe(II)by Sunset Yellow

LI Gaixian，LI Jianqing＊
（Chemistry and Chemical Engineering of Jingzhong College，Jingzhong 030600，China）

Using the mechɑnism thɑt hydroxyl free rɑdicɑls produced by Fenton reɑction cɑn mɑke the sunset yellow fɑde, the dischɑrge of hydroxyl free rɑdicɑls wɑs meɑsured indirectly.The resistɑnce of performɑnce of ɑscorbic ɑcid ɑnd hydroxyl⁃ɑmine hydrochloride in different soluion to the hydroxyl free rɑdicɑl oxidɑtion were compɑred.Results showed thɑt the ɑnti⁃oxidɑnt cɑpɑcity of ɑscorbic ɑcid ɑnd hydroxylɑmine hydrochloride in 50%ethɑnol solution is better thɑn ɑscorbic ɑcid ɑnd hydroxylɑmine hydrochloride in ɑqueous solution.The recovery rɑtes of ɑscorbic ɑcid ɑnd hydroxylɑmine hydrochloride in 50%ethɑnol solution ɑre 107.2%,104.2%respectively.The recovery rɑtes of ɑscorbic ɑcid ɑnd hydroxylɑmine hydrochlo⁃ride in ɑqueous solution ɑre 90.2%,96.0%respectively.

Hydroxyl rɑdicɑl；Sunset yellow；H2O2-Fe（II）；EDTA-Fe（II）

O 657

A

1674-4942（2014）03-0277-03

2014-05-04

国家自然科学基金（21175086）；山西省高校科技研究开发项目（20111026）；山西省大学生创新实验项目（2012350）；山西省高校“131”领军人才工程资助项目689

*通讯作者