尉志鹏 杨海艳 高天宇 魏哓晶 邵倩倩 杨 帅 解雪飞 杨志孝

(1.泰山医学院计划生育本科，2.泰山医学院分析实验室，山东 泰安 271000)

大豆异黄酮是大豆中存在的具有特殊结构的生物活性物质，具有抗肿瘤作用、对血管的防护作用、抗氧化活性、抗炎、改善骨质疏松、类似女性雌激素作用以及抗激素作用等，已越来越引起社会和学术界普遍关注[1-4]。国内外关于大豆异黄酮的研究多侧重于大豆遗传因素和某些外源性因素对其含量的影响以及其研究前景的展望等方面，而刺激生长中的豆芽来提高大豆异黄酮的含量水平的研究未见报道。本实验以豆芽为研究材料，利用物理因素刺激的方式，提高豆芽中大豆异黄酮的含量水平。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料试剂 小黄豆(山东圣源有机非转基因大豆)、大豆异黄酮标准(sigma)、无水乙醇(AR.)、95%乙醇(AR.)、亚沸蒸馏水。

1.1.2仪器设备 TG332A微量分析天平(上海精度0.01 mg/20g)，k-30高速冷冻离心机(sigma公司)，UV-2800紫外分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)，光照培养箱(GZX-400BSH-Ⅲ,上海新苗医疗器械制造有限公司)，鼓风干燥箱(BGZ-146,上海博讯实业有限公司)，真空干燥箱(DZF-6210，上海精宏制造厂)，昆山超声提取器、加样器(德国产)。

1.2方法

1.2.1大豆的筛选及豆芽的培育 对购买的优质小黄豆进行筛选去除残次，用26℃的温水浸泡12 h进行催芽。选择无菌培养皿，首先放入4层医用无菌纱布，将筛选出的黄豆均匀铺在培养皿中，洒上适量自来水使纱布保持适宜湿度，在光照培养箱中26.5℃温度进行无光培养，视干湿情况喷洒自来水保持适当的湿度。

1.2.2刺激因素的选择 方案一：将铺有黄豆的培养皿均分为5组，编号1～5。1组采用常规方法(26.5℃条件下，无光)培养，不采取任何物理刺激。2组采用单一温度(30℃)刺激；3组采用单一温度(40℃)刺激；4组采用单一紫外(254 nm波长)刺激；5组采用单一紫外(359 nm波长)刺激。以上2～5组，大豆发芽过程中每日定点刺激2次，每次10 min。方案二：将铺有黄豆的培养皿均分为7组，编号1～7。1组采用常规方法(26.5℃条件下，无光)培养，不采取任何物理刺激。2组采用0℃和50℃大温差冷热刺激，植株0℃条件下刺激10 min后迅速转移至50℃条件下刺激10 min；3组采用0℃和50℃大温差冷热刺激，植株0℃条件下刺激20min后迅速转移至50℃条件下刺激20 min；4组采用模拟紫外辐射使用30 W UV-B灯管(波长为280～315 nm)，灯管悬于植株上方1 m，刺激10 min；5组作为4组对照组，不模拟紫外辐射，其它环境条件相同，处理10 min；6组采用模拟紫外辐射使用30W UV-B灯管(波长为280～315 nm)，灯管悬于植株上方1 m，刺激20 min；7组作为6组对照组，不模拟紫外辐射，其它环境条件相同，处理20 min。

1.2.3大豆异黄酮的提取 将豆芽低温自然干燥后，用中药粉碎机分别打成细粉，各准确称取1.0000 g于小烧杯中，加入95%乙醇、料液比1:8，70℃超声提取30 min，取提取液于锥形瓶备用；底物加入95%乙醇、料液比1:8，70℃超声提取40 min，取提取液于锥形瓶中。混匀。冷却后取提取液5 ml转移至50 ml的容量瓶中定容。

1.2.4大豆异黄酮含量的测定 精密吸取一定量定容后提取液，加95%乙醇稀释，摇匀。以95%乙醇溶液作对照，用UV-2800紫外分光光度计(上海)，扫描大豆异黄酮标准溶液与大豆提取液，最大吸收波长为λ265 nm,以265 nm为测定波长，绘制标准工作曲线，于265 nm处直接测定各组大豆异黄酮浓度。

2 结 果

2.1标准工作曲线 绘制sigma大豆异黄酮标准品标准曲线，见图1。回归方程为： Y = 0.0597X - 0.0086，R2= 0.9982。

图1 标准曲线图

2.2方案中各组大豆异黄酮标准曲线的绘制 方案一标准曲线如图2，回归方程为：Y = 17.001X - 0.0022，R2=1。方案二标准曲线如图3，回归方程为：Y = 17.034X + 0.0009，R2=1。

图2 方案一标准曲线图

图3 方案二标准曲线图

2.3大豆异黄酮含量 方案一显示，在豆芽生长过程中给予一定强度温度刺激，能够提高豆芽中大豆异黄酮含量。单一温度(30℃)刺激条件下，异黄酮含量相比常规方法(26.5℃条件下，无光)增加了9.71%；单一温度(40℃)刺激条件下，异黄酮含量相比常规方法(26.5℃条件下，无光)培养增加了5.30%，其作用效果并不明显。在经紫外照射后，豆芽中大豆异黄酮的含量明显降低。见表1。

表1 方案一不同刺激条件下大豆异黄酮的含量

方案二显示，豆芽生长过程中，人为加大温差，用0℃和50℃冷热交替刺激能有效提高异黄酮含量。在恒温培养过程中，选取某一固定时间段对生长中的豆芽加大温差，刺激10 min时，豆芽中异黄酮含量有较高提升，相比对照组提高了44.24%；刺激强度不变，而刺激时间延长至20 min时，豆芽中异黄酮含量反而出现一定程度降低，但仍高于对照组。可见，适宜时间长度的冷热刺激能明显提高豆芽中大豆异黄酮含量，但随着刺激时间的延长，大豆异黄酮含量反而会出现降低趋势。见表2。

表2 方案二不同刺激条件下大豆异黄酮的含量

3 结 论

研究表明大豆异黄酮具有数量性状遗传的特性，受遗传和环境因素影响较大[8]。不同条件的物理刺激对豆芽中大豆异黄酮含量的影响不同。大量对比试验表明，通过模拟极端环境因素，在豆芽生长过程中，人为加大温差、适宜时间长度的0℃和50℃冷热交替刺激能有效提高豆芽中大豆异黄酮含量，较常规恒温(26.5℃)生产的豆芽，大豆异黄酮含量提高了44.24%。单一温度刺激虽能一定程度上影响大豆异黄酮含量，但影响作用不明显。经紫外照射后，大豆异黄酮含量会有一定程度的降低[9-10]。

由此可见，在日常豆芽培育过程中，通过人为加大温差，模拟一定强度的温度刺激，确定适宜刺激时间，能够有效提高豆芽中大豆异黄酮的含量。该法简单易行，适合大规模应用，用该大豆芽作为生产大豆异黄酮原料，可显著降低其生产成本，使大豆异黄酮产品能惠及更多的平民百姓。

此外，随着人们生活水平的提高，对健康保健也越来越重视。豆芽在发芽过程中脂肪以能量的形式被消耗，因此，热量很低；同时蛋白质、多糖被降解为活性肽及低聚糖。豆芽中还含有丰富的维生素C、活性蛋白酶及丰富的膳食纤维素。用此法加工生产豆芽，在保留豆芽原有特性的基础上，提高了其大豆异黄酮的含量，有效提高了豆芽的品质。

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