王晓燕 蔡艳霞 田文洪 赵友恒 杨仁池

(1.深圳市第四(福田)人民医院，广东 深圳 518033； 2.中国医学科学院血液病研究所 血液病医院，天津 300020)

ITP是一种常见的器官特异性出血性自身免疫性疾病。临床上以出血和外周血血小板减少、骨髓巨核细胞数正常或增多伴有成熟障碍为主要表现。目前认为本病是由于患者体内产生抗血小板自身抗体与血小板抗原结合，在单核巨噬细胞系统中与巨噬细胞Fc受体结合，从而导致血小板迅速从循环中清除，同时还作用于骨髓巨核系细胞，影响其增殖、分化及成熟[1]。发病机制尚未完全阐明,但现在公认主要与细胞免疫、体液免疫功能异常有关[2-5]。

瘦素(Leptin)是肥胖基因(ob gene)编码，脂肪细胞产生的一种激素样细胞因子,是由167个氨基酸组成的蛋白质。最近的研究发现瘦素可以活化CD4+T辅助细胞[6]。瘦素水平下降导致免疫抑制,慢性瘦素缺乏者Thl型细胞功能下降而Th2型细胞功能上升。随着瘦素含量与自身免疫疾病有密切关系的报道[7]，研究瘦素在免疫相关性疾病中的发病机制倍受学者关注。瘦素受体(Ob-R) 属Ⅰ型细胞因子受体家族,人的Ob-R 有长型(Ob-RL) 和短型(Ob-RS)两种。Matarese[8]发现在T 细胞、血管内皮细胞和CD34+的骨髓造血干细胞上有Ob-RL 表达 。Bennett等于1996年发现CD34+的造血干细胞表达瘦素受体，同时联系骨髓基质中的脂肪细胞可分泌瘦素，提出瘦素为造血细胞的发育提供增殖信号，并且发现这一增殖信号是由瘦素的长型受体转导的。该项研究提出，瘦素主要作用于多系祖细胞阶段，从而引起红系、髓系、淋巴系造血细胞增殖。

有学者曾对46例慢性特发性血小板减少性紫癜患者进行检测，结果表明血清瘦素水平均升高，与血小板计数呈负相关，与血小板相关抗体IgG呈正相关[9]，其后通过进一步研究得出CITP患者血清瘦素水平升高的同时，可溶性瘦素受体(sOb-R)水平下降。瘦素可增强CITP患者脾细胞和外周血单个核细胞分泌血小板相关抗体IgG的能力。瘦素还可增加血小板活化T细胞[10]。以上这些发现说明瘦素可能与CITP的发病机制有关。

血小板生成与巨核细胞的正常凋亡密切相关，巨核细胞局部发生Caspase依赖的细胞凋亡启动了血小板前体的形成，巨核细胞的凋亡受阻或不能发生正常形式的凋亡，会影响到血小板生成。CITP患者血清瘦素水平升高，血小板计数下降，本实验旨在研究瘦素对CITP患者骨髓巨核细胞增殖分化与凋亡的影响来进一步探讨ITP在巨核细胞方面的发病机制,从而为ITP的防治提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 急性巨核细胞白血病细胞株M07e(中国医学科学院血液病研究所)；重组人瘦素(美国R&D公司)；Agaros琼脂糖(上海Yito公司)；BSA(Roche Diagnostics Corp)；淋巴细胞分离液(中国医学科学院血研所科技公司)；GM-CSF(美国R&D公司)；M-MLV(美国GIBCO/BRL公司)；Oligo dT(上海生工生物工程公司)；DMSO(国产分析纯)；谷氨酰氨(美国GIBCO公司)；重组人血小板生成素注射液(TPO)(沈阳三生制药股份有限公司)；RPMI1640固体培养基(美国GIBCO公司)；牛血清白蛋白(Roche Diagnostics Corp)；SERUM-FREE MEDIUM(美国Stemcell公司)；Brdu-ELISA试剂盒(美国Roche公司)；Annexin V-FITC凋亡试剂盒(美国BD公司)。

1.2研究对象 10名CITP患者(7名女性，3名男性，中位年龄23岁)均为我院血液科住院患者。以急性巨核细胞白血病细胞株MO7e作为对照。所有病例均符合诊断标准。骨髓标本采集时,多数患者在接受糖皮质激素和静脉丙种球蛋白治疗，少数应用免疫抑制剂治疗。

1.3实验方法

1.3.1M07e细胞培养 M07e细胞复苏后，接种于含20%FCS(胎牛血清)、5 ng/ml GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、2 mM-谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml链霉素的RPMI1640培养基中，在37℃，5%CO2孵箱中培养。每1～2天传代一次。取对数生长期的细胞进行各项实验。

1.3.2RT-PCR检测M07e细胞瘦素受体(长型和短型)mRNA表达 按Invitrogen公司Trizol总RNA分离试剂盒抽提总RNA。取2 μg RNA根据Takara公司的逆转录酶体系转录为cDNA，按下述反应条件在PCR仪上进行扩增，94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 7 min，共35个循环。瘦素受体长型(Ob-RL) 和短型(Ob-RS)及作为内参照的β-actin基因引物用软件Primer Premier 5.0设计，Ob-RL的上下游引物分别为GCTATTTTGGGAAGATGT和TGCCTGGGCCTCTATCTC(501bp)；Ob-RS的上下游引物分别为CATTTTATCCCCATTGAGAAGTA和CTGAAAATTAAGTCCTTGTGCCCAG(271bp)；β-actin的上下游引物分别为CAGAGCAAGAGAGGCATCC和CTGGGGTGTTGAAGGTCTC(217bp)。扩增结束后产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)ELISA法检测M07e细胞在瘦素作用后的增殖 取对数生长期的细胞，用含20%FCS、5 ng/ml GM-CSF的RPMI1640调整细胞浓度为1×106/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，复种3孔，不同浓度的瘦素共培养，设7个瘦素浓度组(0、5、10、25、50、100、200 ng/ml)。同时以加TPO(50 ng/ml)组作为阳性对照,以排除假阴性结果。于37℃，5%CO2孵箱中分别培养24、48、72小时。实验预设空白对照组和背景对照组：空白对照组不加细胞只加培养液和实验试剂，背景对照组除不加标记液外其余条件同实验组。严格按照美国Roche公司的Brdu ELISA试剂盒的操作步骤进行。加入终止液后尽快在5 min内用酶标仪在450 nm波长处测光吸收值，参照波长690 nm。比色结果减去空白对照为实验结果。背景对照旨在去除非特异性影响，应小于0.1。

1.3.4Annexin V/PI双标流式检测瘦素对M07e细胞的抗凋亡作用 取对数生长期细胞，用含20%FCS、5 ng/ml GM-CSF的RPMI1640调整浓度为5×105/ml接种于6孔细胞培养板中,每孔2 ml。设3个浓度的瘦素共培养(10、50、100 ng/ml)，分别于药物作用24、48、72小时后收集细胞，以不加瘦素组作为对照。按照美国BD公司的AnnexinV-FITC凋亡试剂盒说明处理，将6个孔里细胞分别加入流式管中1000 r/min，4℃，5 min离心。弃上清，每管加1 ml冷PBS，轻震荡使细胞悬浮。1000 r/min，4℃，5 min离心，弃上清。将细胞重悬于100 μl 1×binding buffer。加入5 μlAnnexinV-FITC和5 μl PI,轻轻混匀，避光室温孵育15 min。每管加入400 μl 1×binding buffer，1小时内上流式细胞仪检测。

1．3.5瘦素对CITP骨髓CD34+细胞向巨核系定向分化的影响

1.3.5.1CITP骨髓CD34+细胞的分选 采集骨髓10～20 ml，肝素钠抗凝，用PBS(含2 mM EDTA)按1:1体积稀释骨髓液，再用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)分离单个核细胞(MNC)，按照德国美天旎公司CD34磁珠分选说明分选CD34+细胞。取2×105细胞分别标记PE-CD34+抗体,PE-Mouse IgG1(κ)同型对照，用流式细胞仪检测CD34+细胞的纯度。

1.3.5.2细胞培养 新鲜分离的骨髓CD34+细胞分别接种在含TPO(100 ng/ml)+SCF(50 ng/ml),TPO(100 ng/ml)+SCF(50 ng/ml)+Leptin(10 ng/ml),TPO(100 ng/ml)+SCF(50 ng/ml)+Leptin(50 ng/ml),TPO(100 ng/ml)+SCF(50 ng/ml)+Leptin(100 ng/ml)的无血清培养基的24孔培养板中，每孔终体积为1ml,细胞终浓度为1×105/ml，培养条件为37℃,5%CO2，每3～4天半量换液，补充细胞因子，在第7、10、14天取出部分细胞进行计数，并作流式CD41a+、CD61+检测。

1.3.5.3流式细胞仪测定培养细胞分化过程中CD41a+、CD61+的表达 取培养7、10、14天的细胞(5×105)离心去培养液，用PBS洗1次， 剩余约100 μl细胞悬液，分别加5 μl APC-CD41a，PE-CD61单抗,同型对照为Mouse APC-IgG1(κ),PE-IgG1(κ)单抗，混匀后室温避光孵育30 min，离心去上清并用PBS洗2次，将细胞固定在0.4 ml 1%多聚甲醛中，流式细胞仪测定CD41a+细胞、CD61+细胞的表达。

1.3.6Annexin V-FITC单染法检测瘦素对骨髓CD34+细胞诱导获得的CD41a+细胞凋亡 取培养7、10、14天的细胞(5×105)离心去培养液，用PBS洗1次，将细胞重悬于100μl 1×binding buffer,加入5μl CD41a-APC和5μl AnnexinV-FITC,轻轻混匀,避光室温孵育15 min,加400 μl 1×binding buffer，另外设一同型对照组，加入Mouse FITC-IgG1(κ),APC-IgG1(κ),1小时内上流式细胞仪检测。

1.4统计学分析 统计学分析采用SPSS18.0统计软件，数据采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，各组之间两两比较用LSD方法。P≤0.05认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1RT-PCR结果 琼脂糖凝胶电泳显示瘦素受体长型Ob-RL和短型Ob-RS在501 bp和271 bp位置均有单一透亮条带显示(以β-actin为内参照基因)，表明瘦素受体长型Ob-RL和短型Ob-RS在M07e细胞均有mRNA表达(图1，图2)。

图1 瘦素受体(长型Ob-RL)的RT-PCR扩增产物凝胶电泳图

2.2Brdu-ELISA法M07e细胞增殖 与空白对照组相比，瘦素对M07e细胞的增殖有促进作用，并呈现一定的剂量依赖性，浓度为5 ng/ml即显示出促增殖效应(P=0.037)，但浓度在5、10、25 ng/ml之间无明显统计学差异,两两之间相比P值分别为0.289，0.178，0.76。浓度为100 ng/ml时其增殖效应最大。在时间依赖效应上，瘦素作用48h，其细胞增殖明显高于24 h，而作用72 h其细胞增殖介于两者之间(P=0.000)。见图3。

2.3Annexin V/PI双标流式检测M07e细胞凋亡 与不加瘦素组相比，瘦素对M07e细胞具有抑制凋亡作用(P=0.001)。浓度10，50，100 ng/ml之间无明显统计学差异，两两之间相比P值分别为0.473,0.179,0.492。在时间依赖效应上瘦素作用72小时细胞凋亡率最高,两两相比P值均<0.05,24、48小时之间无明显差异(P>0.05)。见图4。

图3 不同浓度瘦素作用于M07e细胞不同时间后Brdu统计结果(control为阳性对照，TPO浓度50ng/ml)

图4 不同浓度瘦素作用于M07e细胞不同时间Annexin V/PI双标流式统计结果

2.4.1CITP骨髓CD34+细胞的分选结果 收集10份标本,平均体积11.5 ml(10～15 ml),淋巴细胞分离液分离后,单个核细胞平均为(4.93±4)×107，经过MACS磁珠分选后CD34+细胞平均为(1.2±0.65)×106,CD34+细胞纯度可达95%以上。

2.4.2CITP骨髓CD34+细胞诱导分化过程中CD41a+、CD61+的表达情况 分别于培养第7、10、14天流式检测不同浓度瘦素+TPO+SCF诱导分化过程中CD41a+、CD61+巨核细胞表达率，与不加瘦素组相比，培养第7、10天CD41a+、CD61+表达率有所增加，但两两相比P值均>0.05，无明显统计学差异。培养第14天CD41a+、CD61+表达率较不加瘦素组有所减低，但也无统计学意义。在时间依赖效应上，随着培养时间延长，各组CD41a+、CD61+表达率均增高，具有统计学差异(P<0.05)，但与不加瘦素组相比无明显差别。见表1。

2.5Annexin V-FITC单染法检测骨髓CD34+细胞诱导获得的CD41a+细胞凋亡 不同浓度Leptin+TPO+SCF诱导分化过程中CD41a+细胞凋亡率与不加瘦素组相比无统计学意义，两两相比P值均>0.05。随着细胞培养时间的延长，各组凋亡率呈上升趋势，但与不加瘦素组相比亦无明显差别。见表2。

表1 不同时间各组细胞CD41a+、CD61+的表达率

表2 不同时间各组细胞凋亡率的比较

3 讨 论

目前认为慢性ITP是一组与自身免疫有关的疾病。其机制为：抗体介导，即血小板表面有抗血小板的自身抗体，使致敏的血小板遭破坏；抗血小板抗体能与骨髓巨核细胞相结合,使之受损，导致成熟障碍，从而使血小板生成减少。

瘦素是一种具有重要生物活性的多肽类激素，是机体神经一内分泌一免疫调节网络中的重要成员，其在体内的含量与自身免疫性疾病的发生、发展有密切关系。研究瘦素在免疫相关性疾病中的发病机制倍受学者关注。瘦素受体属于I型细胞因子受体家族，推测瘦素在造血调控、免疫细胞的发育及免疫应答中发挥重要作用。

瘦素为造血细胞的发育提供增殖信号，主要作用于多系祖细胞阶段。骨髓中含有大量的脂肪组织，而且高百分比的脂肪细胞是保证建立长期骨髓培养所必需的关键基质元素。脂肪也是瘦素的天然来源地，这可能说明脂肪细胞在骨髓或造血微环境中有产生瘦素的功能，由此来促进造血的进程。瘦素在生理状态下可刺激正常髓细胞系和红细胞系的发育[11]。

在免疫应答方面， T、B淋巴细胞表面均表达ob-R,表明瘦素可直接作用于淋巴细胞影响其功能。瘦素不仅在淋巴细胞生成中发挥促进作用，对于成熟淋巴细胞活化、增殖、执行特异性免疫应答功能也显示出重要作用。瘦素可能对记忆性T细胞的增殖具有抑制作用，而显著增强初始性T细胞的增殖反应[12]。瘦素可诱导人Thl型细胞因子的产生，增强Thl促炎症免疫应答，与健康对照组相比，ITP的患者血清瘦素水平显著增高，推测瘦素诱导的Thl型病理性免疫应答可能与ITP的发病有关，并且有可能成为ITP治疗的新靶点[11]。

CITP患者血清瘦素水平升高，与血小板计数呈负相关，与血小板相关抗体IgG呈正相关，而血小板相关抗体又可导致巨核细胞增殖和成熟障碍，这一关联导致我们推测瘦素可能对巨核细胞起一定作用。

本实验在研究ITP巨核细胞对瘦素的应答差异之前，先通过M07e为研究对象搞清楚瘦素对巨核细胞的作用。瘦素主要由白色脂肪组织分泌，血清瘦素的水平与脂肪的贮积量呈正比，近年研究证实瘦素与肿瘤的发生关系密切[13-15]。本研究结果显示M07e有瘦素受体的表达，与文献报道的结果一致，提示血清中的瘦素可能通过M07e的受体来调节白血病细胞的增殖。肿瘤的生长是由于细胞的增生和和凋亡失衡而造成的。本研究中我们发现瘦素通过促进M07e细胞的增殖，抑制其凋亡来参与肿瘤的发生、发展，具体机制有待于进一步研究。

TPO是近年纯化克隆的巨核细胞一血小板系统的特异性造血调控因子。在巨核细胞的增殖、分化、成熟及血小板生成方面，TPO起重要调节作用。体内外研究显示其对正常人、某些血小板减少症患者的骨髓巨核细胞增殖、成熟及血小板生成均有促进作用。近来有文献报道,TPO 在诱导巨核细胞扩增的同时,尤其是培养后期,会特异性地诱导巨核细胞的凋亡。SCF能有效抑制TPO 介导的细胞凋亡,促进巨核细胞有效扩增,进一步说明体外扩增巨核细胞,SCF 与TPO 的联合是必不可少的[16]。

本研究中我们用TPO与SCF联合定向诱导CITP骨髓CD34+细胞向巨核系分化。用三种不同浓度的瘦素作用于其中，结果表明瘦素在TPO+SCF诱导CITP骨髓巨核细胞分化中无明显协同作用，对分化产生的CD41a+细胞的凋亡也无明显作用。提示瘦素在ITP的发病中可能主要是参与Th1型免疫应答，对骨髓巨核细胞的增殖和凋亡不足以作用，但研究例数较少，尚难作出肯定的结论，需要进一步加大样本量进行研究。

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