潘嘉慧 田 峻 赵亮亮 沈国权 朱海云

（佛山市质量计量监督检测中心，广东佛山 528225）

胶体金免疫层析法快速检测食品和兽药中的氯霉素残留

潘嘉慧 田 峻 赵亮亮 沈国权 朱海云

（佛山市质量计量监督检测中心，广东佛山 528225）

1 引言

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗生素，其抗菌效果好，价格低廉，曾广泛应用于预防和治疗动物疾病。然而氯霉素具有严重的毒副作用，会引起动物机体正常菌群失调，同时可能引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症等疾病。

欧盟2377/90/EEC法规、美国FDA、日本的“肯定列表制度”等均明确规定氯霉素不能在任何动物制食品，以及动物的饲料和生长环境中使用。2002年我国农业部发布235号公告《动物性食品中兽药最高残留量》，规定氯霉素及其盐、酯（包括：琥珀氯霉素）在所有食品动物、所有可食组织中不得检出。

对氯霉素的标准检测方法有色谱分析法和免疫检测法。色谱分析法需要先进检测设备、样品前处理步骤繁琐，费用高、耗时长、对操作人员要求较高。免疫分析法具有快速、灵敏度高、高通量的特点。其中免疫分析方法有酶联免疫法、胶体金免疫层析技术等。酶联免疫分析法操作相对繁琐，对操作人员的专业知识要求较高，相比之下，胶体金免疫层析技术基于肉眼水平的检测，不需任何仪器设备和试剂，比酶联免疫法省略了加显色剂和终止液的步骤，更简化的操作，体积小，易携带，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果，并可保存实验结果。

近年来已有制备氯霉素胶体金免疫层析试纸条的报道，但仍存在适用样品单一、灵敏度不够等不足，本研究特别从优化免疫抗原、包被抗原的结构及优化偶联技术角度出发，提高抗体的特异性、亲和力，从而增加检测的灵敏度和特异性。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

氯霉素、氯金酸、柠檬酸三钠、6-氧代己酸、甲基磺酸、二甲基甲酰胺（Nimethylformamide，DMF）、3-磷酰化二苯酯苯并[D]噁唑-2-酮[2（3H）- Benzoxazolone，3-（diphenoxyphosphinyl）-（9CI），DPBO]、苯并噻唑硫酮（Benzothiazolethione，BTT）：国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）：美国Sigma公司；羊抗鼠IgG、硝酸纤维素膜（NC膜）和金标垫，样品垫，PVC底板，吸水纸：上海杰一生物技术有限公司。

2.2 仪器与设备

Avanti 高速冷冻离心机：美国Beckman公司；UV-2700紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；Ultra Genetic超纯水系统：英国ELGA公司；JY-EQ08划膜喷金一体机：上海杰一生物有限公司。

2.3 实验方法

2.3.1 氯霉素半抗原的合成

图1 氯霉素（a）及其半抗原（b）、免疫抗原/包被抗原（c）的化学结构式

图2 氯霉素（a）及其半抗原（b）、免疫抗原/包被抗原（c）的化学结构式

将200ml的环己烷加入到250ml装有分水器的圆底烧瓶中，依次加入氯霉素（32.3g，0.1mol，化学结构如图1a所示）、6-氧代己酸（15.6g，0.12mol）和甲基磺酸（0.95g，0.01mol），加热回流，随着反应的进行，反应生成的水沉在分水器的底部，继续加热回流，直至分水器中没有新的反应水沉降为止，停止加热。自然冷却反应液至室温，静置过夜。抽滤，滤饼用环己烷洗涤两次，50℃干燥5h后得到40.4g含有羧基的氯霉素衍生物，即氯霉素半抗原（化学结构如图1b所示）。反应式如图2所示。

2.3.2 氯霉素免疫抗原和包被抗原的合成

取氯霉素半抗原1.0mmol溶于30mL的DMF中，冷却至0～4℃，搅拌下加入351mg的DPBO和167mg的BTT，保温反应过夜。加入100mL 10%碳酸氢钠溶液和100ml水，继续搅拌1h，抽滤，滤饼用水洗涤（50mL×2）后用20mL DMF溶解为A液。称取2.0g BSA 溶于200ml的浓度为1.0mol/L的PBS（pH=8）中，加入5ml DMF，在0～5℃下搅拌溶解为B液，将上述A液缓慢滴加到B液中，保温反应8h，离心取上清液，4℃下用生理盐水恒温透析3d，每天更换3次透析液，冷冻干燥后得到免疫抗原。用OVA代替BSA，同样方法制备包被抗原。

2.3.3 氯霉素单克隆抗体的制备

用氯霉素免疫抗原多次免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）在体外融合形成杂交瘤细胞，经选择性培养基筛选，得到阳性杂交瘤细胞株。将其注入小鼠腹腔获取腹水，或利用体外细胞培养收集培养上清液等方式，制备氯霉素单克隆抗体。用硫酸铵沉淀法纯化该抗体，并与等体积甘油混合，低温保存。

2.3.4 胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金：于100ml超纯水中加入1ml1%的柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1ml1%氯金酸溶液，待溶液颜色变为澄清酒红色时，继续加热10min，冷却至室温后，4℃保存备用。

2.3.5 胶体金标记氯霉素单克隆抗体的制备

量取胶体金溶液10ml，将其pH值调整到9.5，搅拌并缓慢加入氯霉素单克隆抗体0.45mg进行标记，持续搅拌30min后，逐滴加入20%的BSA溶液终止反应，持续搅拌1h。4℃下10000 r/mim离心40min，小心弃去上清，取沉淀用金标缓冲液溶解至1ml备用。

2.3.6 胶体金免疫层析试纸条的制备和组装

使用划膜喷金一体机将制备好的金标抗体均匀喷涂到金标垫上，喷金参数4μl/cm，37℃真空干燥8h备用。将适当浓度的包被抗原（氯霉素-OVA偶联物）包被到NC膜的检测线（T线）位置，羊抗鼠IgG包被到质控线（C线）位置，包膜参数1.0μl/cm，晾干备用。将干燥好的样品垫，金标垫，NC膜，吸水纸，按顺序粘贴到PVC底板上，切割成条，组装成卡，分装到铝箔袋，袋内装入干燥剂，密封保存。

2.3.7 样品前处理、检测及判读

（1）样品前处理

①虾、蟹、鱼肉组织：取4g已搅碎的待测样品于15ml离心管中。加入8ml乙酸乙酯，剧烈震荡混合2min。以离心机2300×g（3500rpm）离心5min，取上层有机相6ml至玻璃管中，于60℃下，利用氮吹仪或电吹风将有机溶剂吹干（注：电吹风不要用强热风，以免温度过高）。加入400μlPBST及600μl正己烷回溶，震荡混合。以离心机离心2300×g（3500rpm）10min，吸取最少150μl下层有机相待测，或继续使用C18固相萃取柱净化。

②鸡、猪肉组织：取5g已搅碎的待测样品于50mL离心管中。加入10mL 0.15N（pH值调整至11.4）的NaOH，震荡混合均匀2分钟。以离心机离心2300×g（3500rpm）10分钟，取上层液（NaOH）8ml至另一50ml离心管中并加入12ml二氯甲烷，轻摇混合（避免剧烈震荡）。以离心机离心2300×g（3500rpm）5分钟，取下层液（二氯甲烷）7mL至玻璃管中，于60℃ 下，利用氮吹仪或电吹风将有机溶剂吹干（注：电吹风不要用强热风，以免温度过高）。加入300μL PBST 及加入600μL正己烷回溶，震荡混合。以离心机离心2300×g（3500rpm）10分钟，吸取最少150μL下层液待测，或继续使用C18固相萃取柱净化。

③蜂蜜、牛奶：称取4g 试样于15ml 离心管中，加入2ml 蒸馏水振荡充分溶解。加入8ml 乙酸乙酯，震荡混合8min，离心或静置分层，转移 5ml上层有机相于试管中，氮吹仪或电吹风干。加入 160μl PBST溶解管壁残渣，再加入 1ml 正己烷充分振荡后静置分层，吸取下层水相进行待检。

（2）样品检测

撕开铝箔包装，取出检测卡。取滴两滴检体（约75μl）于加样孔中，等待检体吸附移动至测试区中，等待5min后即可判读结果。

（3）结果判读

①阴性结果：T线比C线深或一样深，表示检品氯霉素浓度低于0.1μg/kg。

②阳性结果：T线比C线淡或几乎看不见，表示检品氯霉素浓度高于或等于0.1μg/kg（包括看不到T线）。

③无效结果：如果测试结果未出现任何色带或是C线未出现，此时表示此试剂已失效、过期或操作不当，需另做一次测试。

3 结果与讨论

3.1 氯霉素半抗原、免疫原/包被原的制备

氯霉素的分子较小，分子量为323.14，不具有免疫原性，需要与载体蛋白偶联后方能具有免疫原性；然而氯霉素是一个化学结构上没有羧基和氨基的半抗原，它本身无法与蛋白偶联，而往往需要使用与氯霉素具有相同抗原决定簇的琥珀氯霉素作为半抗原，或合成其他衍生物作为半抗原[1]，然后与载体蛋白偶联才能成为全抗原。

当前已报道的氯霉素全抗原的合成方法主要有：通过琥珀氯霉素上的羧基与蛋白偶联的混酸酐法[2]、碳二亚胺法[3]；还原苯环上硝基后偶联的重氮化法[4]，羰基二咪唑法和戊二醛法[5]。混合酸酐合成法操作繁杂，中间过程损失较大，且涉及到剧毒药品氯甲酸乙酯；重氮化法利用的是氯霉素抗原苯环上的-NO2，影响氯霉素抗原的免疫原性。戊二醛法易造成载体蛋白之间偶联；羰基二咪唑法法反应体系少水，易导致载体蛋白变性。

本研究特别从半抗原、免疫原/包被原的结构出发，采用全新的连接臂，优化偶联技术和合成路线，同时保证检测特异性和灵敏度。本研究中的氯霉素半抗原保留了氯霉素的抗体识别部位：对硝基苯基部分，从远离特征结构、免疫原性最弱的羟基端引入间隔臂，提高了半抗原的免疫原性，同时保留氯霉素的骨架结构，提高特异性，确保半抗原不受蛋白的屏蔽作用；引入的间隔臂具有一定的长度和适当的极性，将载体蛋白对小分子的电子排布和空间结构的影响降到最低；合成的半抗原有利于提高半抗原与载体蛋白的偶联比，并且能更好地暴露半抗原的抗原决定簇。在免疫分析中，通过对半抗原连接位点，连接臂长度，结构等进行合理选择与搭配，可以有效地利用可预测的交叉反应，达到同时检测某一族化合物的目的，并且可以抑制不可预测的交叉反应，提高检测的特异性。

3.2 胶体金纳米颗粒质量评价

胶体金纳米颗粒的粒径大小与胶体金探针稳定性密切相关。将制备好的胶体金溶液经紫外-可见光分光光度计在400～700nm波长处扫描，测定吸收图谱，结果见图3。由图3可看出，胶体金溶液在525nm出现最大吸收峰，OD525nm=1.82，颗粒大小约为30nm，符合胶体金免疫层析法中胶体金颗粒大小的要求。

图3

3.3 抗原包被浓度的优化

以氯霉素标准溶液0.5μg/L进行检测，优化调整抗原的包被浓度。分别选择包被浓度为0.70，0.75，0.80，0.85mg/ml进行测试选择。取75μl氯霉素标准溶液于样品孔中，溶液沿吸水纸方向移动。首先与金标垫上的金标抗体结合，并一同继续向吸水纸方向移动，到达T线区域。在T线处，溶液中的氯霉素与包被抗原竞争金标抗体，溶液中的氯霉素浓度一定，则包被抗原浓度越大，能够与包被抗原相结合的金标抗体的量越多，胶体金的颜色（红色）越深。由图3可看出，随着包被浓度的增大，T线颜色越深，到0.80mg/ml达到最佳浓度，浓度再增加时颜色基本不变，因此确定最佳膜包被浓度为0.8mg/ml。

3.4 胶体金免疫层析试纸条检测氯霉素的检出限

配制浓度为0.05，0.08，0.1，0.2μg/L氯霉素标准溶液。取75μl标准溶液于样品垫中，层析结束后观察结果。结果表明，随着氯霉素的浓度升高，在C线区胶体金颜色强度相对增大，在T线区胶体金颜色则逐渐变浅，在0.08μg /L时T线颜色明显变浅，在0.10μg/L时T线颜色完全消失。则将T线颜色基本完全消失所对应的浓度定义0.10μg/L为胶体金免疫层析法的检出限，与国家标准方法中使用色谱检测的测定低限相当，但相比之下胶体金检测试纸条的价格等优势不言而喻。

3.5 胶体金免疫层析试纸条检测氯霉素的特异性

抗体的特异性是衡量抗体质量的重要指标。选取了6种氯霉素结构相似物（甲砜霉素、氟甲砜霉素、青霉素、庆大霉素、链霉素、四环素）进行特异性试验，添加浓度均为10μg/L，T线显色明显，即均为阴性，而氯霉素阳性对照试液只有C线显色，T线不显色，显示为强阳性，表明本试验研制的氯霉素胶体金试纸条特异性表现良好，与测试的6种类似物均没有交叉反应现象。

3.6 样品前处理对检测结果的影响

样品前处理是指样品的制备以及对样品中氯霉素残留进行提取，净化以及浓缩富集的过程。目的是消除基质影响，提高检测方法敏感度以及准确度。在检测过程中样品的前处理即小分子的充分提取是否得当不仅直接影响检测结果，而且前处理方法的改善对提高试纸条检测体系的灵敏度也具有重要意义和直接影响。目前检测氯霉素的标准中均提及用固相萃取柱对提取液进行净化处理，相应产品包括：C18柱，硅胶柱，弗罗里硅土柱，PRS（丙磺酸）交换柱，HLB（混合型强阳离子）柱。本研究针对各类肉类组织、蜂蜜、牛奶等样品设计出不同的提取方案，并分别用C18固相萃取柱进行净化，以探讨固相萃取净化对检测灵敏度的影响。从下表中可看出：

（1）对于虾、蟹、鱼肉组织和牛奶样品，当加标浓度为0.1μg/kg时，无论前处理是否经过固相萃取柱净化，试纸条的T线均不显色；当加标浓度为0.3μg/kg时，提取物不经过固相萃取柱净化，试纸条的T线不显色，提取物经过固相萃取柱净化，试纸条的T线显色；当加标浓度为0.5μg/kg时，无论前处理是否经过固相萃取柱净化，试纸条的T线均显色。

（2）对于蜂蜜样品，当加标浓度为0.1μg/kg时，提取物不经过固相萃取柱净化，试纸条的T线隐约可见，经过固相萃取柱净化，试纸条的T线显色明显。

样品虾、蟹、鱼肉组织鸡、猪肉组织蜂蜜牛奶0.1不净化－－±－净化－－＋－0.3不净化－－＋－净化＋＋＋＋0.5不净化＋＋＋＋净化＋＋＋＋加标浓度（µg/kg）前处理方法4

4 结论

近年来胶体金免疫层析技术广泛应用于食品安全快速诊断领域。本研究通过优化偶联技术路线，以达到结构优化，提高抗体质量，从而进一步增加氯霉素免疫胶体金快速检测的灵敏度和特异性的免疫抗原和包被抗原。本实验成功研制出氯霉素快速检测试纸条，灵敏度高、特异性强、稳定性好，除了样本预处理外的测试时间仅需五分钟，与ELISA方法相比，快速、简便、成本低，可操作性强，为广大的动物源性食品加工企业、检测部分现场监测等提供了一种有效、便利的方法，值得推广。

[1] 罗舜菁.对甲基苯甲酸连接的氯霉素全抗原合成与鉴定[J].食品工业科技，2011，（3）：200-203.

[2] 王雪.氯霉素全抗原的合成与鉴定[J].生物技术通报，2008，（1）：177-180.

[3] KOLOSOVA A Y，SAMSONOVA J V，EGOROVA M. Competitive ELISA of chloramphenicol：Influence of immunoreagent structure and application of the method for the inspection of food of animal origin[J]. Food and Agricultural Immunology，2000，12（2）：115-125.

[4] 王桂枝，石德时，毕丁仁，等.中国兽医学报[J]. 1998，18（2）：163-167.

[5] 吴媛媛，包永明.氯霉素全抗原的合成与鉴定[J].化学通报，2005，（6）：458-463.

[6] Chappey ON，Sandouk P，Scherrmann J G. Monochonal antibodies in hapten immunoassays[J]. Pharmaceutical Research，1992，9（11）：1375-1379.