代 鹏，陈海琴，顾震南，张 灏，陈永泉，陈 卫

(江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)又称多烯酸，一般指含有的双键个数不小于两个且碳链长度为16～22个碳原子的直链脂肪酸，可分为ω－6和ω－3等系列。ω－6系列PUFAs主要有亚油酸(Linoleic acid，LA，18∶2)，γ－亚麻酸(γ－Linolenic Acid，GLA，18∶3)、花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA，20∶4)等;ω－3 系列 PUFAs主要有 α－亚麻酸(α－linolenic acid，ALA，18∶3)，二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA，20∶5)，二十二碳五烯酸(Docosapentenoic acid，DPA，22∶5)以及二十二碳六烯酸(Docosapentenoic acid，DHA，22∶6)［1］。

PUFAs中应用较为广泛的有 ARA、EPA、DHA等。ARA是人体前列腺素合成的重要前体物质，它具有增加血管弹性和提高免疫力等生理功能，在促进婴幼儿大脑发育、预防心脑血管疾病方面以及化妆品、保健品领域都有较好的作用［2］。EPA能降低血液胆固醇水平以及动脉粥样硬化发生风险［3］。DHA是大脑和视网膜的重要构成成分，在提高婴幼儿智力等方面具有重要作用。

鉴于PUFAs的应用十分广泛，其生产受到越来越多的重视。以ARA为例，因其多来自于动物肝脏和鱼油等材料，原料来源受到限制，加上环境污染等因素，其产量存在不可持续性风险。利用微生物发酵生产ARA，由于发酵条件比较容易控制、油脂产量高和成本相对较低等优势，越来越受到研究者的重视。目前生产ARA的微生物主要有被孢霉、微藻和油脂酵母。本文选择的目标菌株为高山被孢霉，高山被孢霉是目前产多不饱和脂肪酸(PUFAs)真菌中唯一具有正式安全性评估的菌种(GRAS)［4］，其PUFAs含量极为丰富，总的脂肪含量达到菌体生物量的50%。

高山被孢霉(Mortierella alpina，M.alpina)属于接合菌纲毛霉目被孢霉科被孢霉属［5］，为丝状的腐生菌，广泛分布于土壤内、牲畜的粪便中及其它腐败的有机物质中。M.alpina的无性繁殖是依靠无性孢子进行的，无性孢子多由气生菌丝体的顶部或侧部细胞形成，或者是由分生孢子梗等特殊菌丝通过断裂成熟而形成。M.alpina通过接合孢子的产生进行有性繁殖，其产脂机理为当M.alpina处于适宜生长的营养环境条件中，细胞内各种代谢活动处于平衡状态，代谢平衡被打破时尤其是氮、磷、锌、镁等营养元素缺乏但碳源充足时，M.alpina即停止生长而进入脂质积累期［6］，通过限制培养基中的氮源，产脂微生物将多余的碳源转化为脂质。但目前也存在一种共生脂质合成机理，即随M.alpina的比生长速率增加，脂质合成同步增加，其机理尚不清楚［7］。M.alpina产生的油脂中不饱和脂肪酸的种类较为丰富，常温条件下包括LA、GLA、ARA等，低温条件下还包括ALA、EPA等，图1是本实验室总结的M.alpina ATCC32222中PUFAs合成途径和脂质组数据［8］。

图1 M.alpina ATCC32222中PUFAs合成途径与脂质组数据［7］Fig.1 Predicted PUFAs lipoqenesis pathway and lipids detected by lipidomics in M.alpina ATCC32222［7］

M.alpina发酵生产油脂过程中，菌体形态受菌种、氮源和矿物质种类、溶解氧含量等因素的影响。M.alpina常见的形态为丝状和球状，在某些条件下呈现放射羽状的中间形态。菌体形态对M.alpina产PUFAs的影响主要体现在不同形态下的传质速率不同。Higashiyama等［9］对 M.alpina 1S－4 产 ARA 过程中的形态变化进行分析后发现，丝状和球状之间可以互相转化并且二者比例保持恒定，小球状(直径为1～2mm)菌体中ARA含量明显高于丝状和大球状(直径2～3mm)菌体中的ARA含量，可能的原因是菌体形态在丝状和球状之间转化的过程中，球状中的受损菌丝以ARA为原料修复细胞膜和细胞壁，导致ARA损耗，同时与大球状菌体相比，小球状菌体的比表面积较大。该结果与Koike等［10］的研究结果类似。

目前用于生产ARA的M.alpina的菌株主要有M.alpina ATCC 32222、M.alpina 1S－4、M.alpina CCF185等，本文将探究它们的培养基组分和培养条件对菌体生长和产物合成的影响。

1 培养基组分

M.alpina的培养基组分中的主要影响因素包括碳源、氮源、矿物质元素、其他添加物等。其中，碳源种类包括一些糖类如葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、淀粉等，还包括甘油等其它醇类物质。有关氮源的论述包括有机氮源、无机氮源及以此为基础的混合氮源的影响作用探讨。矿质元素影响作用的侧重点为其对菌体形态的影响，而其他添加物质主要作为目的产物的合成前体来讨论。

1.1 碳源的影响

Jang等［11］研究了可溶性淀粉、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘油五种碳源对M.alpina ATCC 32222产脂能力的影响，结果发现，在以硝酸钾与酵母提取液为2∶1(w/w)作为混合氮源、培养温度为20℃、碳氮比为5.1～9.0时，10%的可溶性淀粉溶液对M.alpina产ARA和PUFAs的促进作用最强，该条件下每克碳源可产生17.4mg LA、17.0mg GLA、103.0mg ARA 以及194.2mg总PUFA。

Nisha等［12］比较了葡萄糖、果糖、淀粉、棉籽糖、鼠李糖、甘露糖对M.alpina CBS 528.72生物量及产脂的影响，结果发现葡萄糖对该微生物生长和产脂的作用效果最好，生物量和总脂量分别为6.8g/L和40.2%(w/w)。含鼠李糖培养基产 ARA最多，达40.41%，但鼠李糖的生产成本较高，不适宜大规模发酵生产。

鉴于合成培养基成本较高，不利于M.alpina工业化生产PUFAs，因此探究使用天然培养基如工业废液作为生产原料显得尤为重要。Cheng等［13］对M.alpina NRRL 5513利用蔗糖废液、豆粕废液和粗豆油生产EPA进行研究后发现，利用豆粕废液与粗豆油进行生产，M.alpina NRRL 5513在变温培养条件下的EPA产量可达总脂的13%(w/w)，这表明在一定的条件下使用天然培养基作为M.alpina的发酵产脂的生产原材料，在显著降低成本的同时仍能满足工业生产要求。

1.2 氮源的影响

Park等［14］研究了氮源对M.alpina产生 ARA的影响，并使用镜像分析系统对菌丝体的几何性质进行分析，结果发现在所用氮源为酵母提取液、蛋白粉、玉米浆时，菌丝体多为球型，而使用棉籽粉、鱼精粉、豆粕粉作为氮源时，菌丝体呈含丝状结构的放射羽状。豆粕培养后发酵液中的丝状结构比例达75%，每克细胞干重中ARA含量为0.14g，为酵母提取液中的两倍，同时表明放射羽状的菌体形态更适合M.Alpina发酵生产ARA。

Nisha等［12］比较了蛋白胨、酵母提取液、硝酸钠、硫酸铵、硝酸钾、尿素、硝酸铵、氯化铵、酪蛋白作为氮源对M.alpina产ARA的影响，尽管使用蛋白胨时菌体产总脂量最多，达42.0%(w/w)，但ARA产量仅占总脂含量的28.74%，低于用酵母提取液时的ARA所占总脂含量(35.28%)。其他几种物质作为氮源时效果均不够理想。

本实验室张静等［14］采用脱脂豆粉和硝酸钾比例为3∶2作为氮源，培养至192h时，与硝酸钾单独作为氮源相比，使用混合氮源条件下ω－3 PUFAs的产量略有下降，而发酵成本可以大幅度的降低，可满足大规模发酵培养要求。这与Jang等［11］的研究思路类似，以硝酸钾与酵母提取液为2∶1(w/w)作为混合氮源来生产ARA时效果最佳。因此使用混合氮源是M.alpina进行工业化发酵生产PUFAs的最好选择。

1.3 矿质元素的影响

Higashiyama等［16］研究了不同的矿质元素对M.alpina 1S－4的菌丝形态和ARA产量的影响。在添加一定浓度的 K+、Na+、Ca2+、Mg2+时，M.alpina 菌丝形态为直径1～2mm的小球状。若只添加K+，菌丝体的主要形态为丝状，这会导致表观黏度增加，因而需要更高的剪切力，最终导致菌体受到破坏。若培养液中只添加 Na+、Ca2+、Mg2+，M.alpina 菌体形态为直径2～3mm的大球形，导致传质受阻而使ARA产量降低。推测可能的原因是添加了K+情况下的菌体初始生长速率较高，形成的较长菌丝因搅拌而破裂后形成了大量的菌丝片段，进而产生了大量的丝状菌体。Ca2+等聚合阳离子可引起菌丝体聚合成球状［17］。

范益春［18］等研究了磷限制对M.alpina产脂情况的影响，在限制磷(初始磷浓度为0.7g/L)的条件下，发酵周期可由7d缩短至5d，细胞干重和油脂含量分别达到42.6g/L和21.6g/L，相比原始条件下分别提高了14.8%和11.3%，这也印证了前述的产脂机理。

1.4 其他添加物的影响

其他添加物主要指除碳、氮源等基本培养基组分外的有利于M.alpina产脂的物质，一般这种物质主要作为目标产物的合成前体并可能兼有碳氮源的作用，或者可以作为微生物生长的生长因子。Shimizu 等［19］利用 M.alpina 20－17 生产 EPA 时，在以葡萄糖、酵母膏为主要碳、氮源的培养基中添加或不添加α－亚麻酸，28℃培养，结果添加有α－亚麻酸的培养基培养的菌丝中有较高含量的EPA产生，产量为63.1μg/mL。在最佳培养条件下培养M.alpina 20－17，结果亚麻籽油中5.1%α－亚麻酸转化为EPA，且EPA产量达到1.35g/L(4.15mg/g干菌丝)，相当于总菌体脂肪酸的7.1%。鲍时翔等［20］用Mortierella sp.M10发酵生产ARA时在培养基中添加一定量的玉米油、橄榄油和豆油，结果显示它们均有利于ARA的合成，其中以添加质量分数为0.02%橄榄油时的效果最好。

Jang等［11］比较了玉米油、猪油和亚麻籽油三种不同添加物对M.alpina ATCC 32222产脂的影响，结果发现添加亚麻籽油的效果最好，每克碳源可产生403.4mg ALA、123.1mg ARA、33.6mg EPA 以及共943.2mg 总 PUFAs。

Yu等［21］在M.alpina M18培养基中添加谷氨酸盐，结果发现谷氨酸盐的添加有利于M.alpina的生长、底物代谢和ARA的产生，并且0.8g/L谷氨酸盐的促进效果最好，产ARA达1.41g/L，比对照组高出0.56g/L。此外添加B族维生素能够促进M.alpina产生ARA［22］，这主要是因为B族维生素可作为ARA合成过程中关键酶如苹果酸脱氢酶等的辅酶。

2 培养条件

培养条件主要涉及培养基中的碳氮比、溶氧量、温度、pH及初始葡萄糖浓度等。它们的共同点是都作为M.alpina生长和产脂创造基本的培养环境，同时各因素的侧重点又有所不同，比如研究碳氮比和溶氧量时，主要侧重于它们对菌体形态变化的影响。

2.1 碳氮比的影响

Stredanska等［23］以葡萄糖为碳源、硝酸钠为氮源时来研究碳氮比对M.alpina CCF185发酵生产ARA的影响，发现碳氮比为40时ARA产量最高，但碳氮比对ARA产量影响不显著。该研究所选取的碳氮源种类较少，并且没有对碳氮源对菌体生物量以及形态的动态变化的影响作深入探究。

Koike等［10］从摇瓶和发酵罐培养两个方面研究了培养基的碳氮比对M.alpina CBS754.68菌体形态和ARA产量的影响，结果发现在碳源和氮源初始总浓度为50g/L时，碳氮比低于7时，随碳氮比升高细胞生长量明显增加;碳氮比为7～15时，碳源被利用的方向从细胞生长转向脂类合成;碳氮比为15～32时，脂类合成十分活跃;当碳氮比高于15时，氮源的限制作用导致菌体生物量减小，但脂类合成仍然增加。氮过量时，生物量与氮源量成正相关，而ARA合成量与氮源量成负相关。碳源过量时，总脂肪酸含量与氮源量成正相关而ARA保持不变。从ARA合成方面来说，适宜碳氮比为15～20，在该范围内，菌体颗粒体积和环状区域的宽度并未随碳氮比变化而发生改变，即碳氮比对菌体形态影响不大。然而，碳氮比高于20时，菌体颗粒体积和环状区域的宽度随碳氮比增大而增大。

2.2 溶解氧含量的影响

Higashiyama等［24］用两种方法，即溶解氧法和顶压法研究了在3～50ppm范围内溶解氧(dissolved oxygen，DO)含量对 M.alpina 1S－4的菌体形态和ARA合成的影响。溶解氧法中，采用纯度20%～90%的氧气供应，而顶压法则控制顶压为180～380kPa。结果发现，最适DO量为10～15ppm，该条件下ARA产量为7ppm下的1.6倍。溶解氧法中的DO量超过15ppm时，菌体形态由丝状或羽状向球状转变，可能的原因是高氧和营养物质可能引起菌体表面的部分结构裂解，进而形成较为光滑的球状，同时导致ARA产量下降。顶压法中的菌体形状并未发生明显改变，这可能由于溶解的CO2的量的增大，CO2对ARA产生的负效应增加［25］。实际生产中溶解氧法更为实用。

2.3 温度的影响

M.alpina生长及产脂的适宜温度范围为15～25℃，低温利于产脂，但同时会降低细胞生长速率。在20℃下培养，其延滞期为34h，对数期介于72h和120h，稳定期介于120h和168h，192h后进入衰亡期，72h菌体产GLA最多，120h产ALA最多，144h产总PUFA 最多［11］。Baipai等［26］认为温度由 25℃ 升至28℃时，M.alpina ATCC 32222的生物量和ARA产量明显降低，10～15℃内才可检测到EPA，表明不同种类的PUFA的发酵生产适宜的温度存在差异。

Peng等［27］在 15～25℃ 范围内研究了 M.alpina ME－1产ARA的温度调控状况，结果表明M.alpina生长的最适温度为25℃，ARA积累的最适温度为20℃，因而采用变温培养策略。实验中前108h采用25℃，之后采用20℃，采用此方法后细胞干重由34.7g/L增至36.7g/L，ARA产量由7.3g/L增至9.2g/L，后者增幅达26.1%。对M.alpina CBS 528.72的研究发现，温度高于30℃或低于25℃时菌体生长被拖延，高于35℃菌体则停止生长，产 ARA最适温度为25℃［12］。该实验结果与 Cohen 等［28］的研究结果不同的原因是实验菌株有差异，由于低温下溶解氧含量较高而同时去饱和酶为氧依赖型所致。

2.4 pH的影响

pH对M.alpina的生物量和ARA产量均产生影响。pH低于4或高于9时，M.alpina菌体完全停止生长，菌体生长和产脂的适宜pH范围为5.5～6.5。初始pH为6.0～6.5对生物量不产生显著影响。培养环境pH为6.0时总脂产量最高，6.5时ARA产量最大(占总脂 34.72%)［12］，这与 Lindberg 等［29］的研究结果相吻合，后者在25℃和pH为6.5时获得最高的ARA的产量(占总脂量的31%)。

2.5 初始葡萄糖浓度的影响

由前所述可知含高浓度碳源、低浓度氮源的培养基有利于M.alpina产脂，但是初始葡萄糖浓度过高对M.alpina的生长有抑制作用，主要原因是高浓度葡萄糖形成的高渗透压使M.alpina失水，从而影响菌体的正常生长。解决的方法除了采用甘油替代葡萄糖作为碳源外，还可以在直接使用葡萄糖作为碳源的条件下，通过先控制相对较低的初始葡萄糖浓度而在后续培养中通过补料的方法实现。Zhu等［30］发现低初始葡萄糖浓度(50g/L)和氮源含量为3g/L的条件可缩短延滞期，20g/(L·d)的葡萄糖和1.5g/(L·d)的硝酸盐在第3、4、5d 加入，第8d 可得到最多ARA(7.74g/L)。实际应用中在缩短延滞期的同时应使最终的发酵时间缩短。

3 高山被孢霉菌种改良

目前，国内外对M.alpina产PUFAs合成通路的研究主要集中在脂肪酸合成途径中脱饱和酶和延长酶的功能验证。采用的手段包括:通过物理或化学诱变使通路中的某个酶失活，进而通过分析PUFAs产物反推其催化底物的能力;根据相关物种中PUFAs通路酶的序列同源性，通过PCR扩增得到基因后将其克隆至异源宿主菌进行功能验证［31］;通过过表达PUFAs通路中关键的酶基因，提高对应多不饱和脂肪酸的产量。目前在这方面关于M.alpina的研究集中于 M.alpina 1S－4和M.alpina ATCC32222(另一保藏菌名为M.alpina CBS 210.32)两株菌。典型的研究工作包括 Eiji Sakuradani［32］等已确定两株ω－3脱饱和酶缺陷型菌株中ω－3脱饱和酶的突变位点，该位点的氨基酸被取代从而导致ω－3脱饱和酶活性丧失。Kikukawa等［33］将 ω－3脱饱和酶基因从M.alpina 1S－4中分离后导入酵母中进行表达，从而确认了此基因的多重功能。对M.alpina进行分子改造也受到了越来越多的重视，Ando等［34］通过农杆菌介导过量表达M.alpina 1S－4中的ω－3基因，可使EPA产量提高 10倍。Sakuradani等［35］发现，在 M.alpina野生型菌株和M.alpina 1S－4的delta－5脱饱和酶缺陷型菌株中过表达内源性ω－3基因后，EPA达到了总脂含量的30%。但另有研究发现，对该缺陷型菌株进行基因缺陷修复后EPA的含量同样上升，所以这方面的研究还缺乏一个很好的研究体系，今后的研究将会集中于选择更为严格的表达系统。

国内的相关专利包括一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法［36］等，仅限于较为基础的菌种的筛选和诱变，本实验室在M.alpina培养条件优化和菌种分子生物学改造方面也进行了一些前期研究工作［7，15，37］。国外的相关专利涉及 M.alpina 中脂肪酸 C16/18 延长酶［38］和磷脂酸酰基转移酶［39］等的功能研究，此外还包括有关M.alpina发酵生产二十碳二烯酸等［40］发酵工艺方面的国际专利。目前国内对于M.alpina培养基条件优化多限于实验室研究，即探究合成或半合成培养基对M.alpina产脂的影响，该类研究尚未应用到工业化生产。

4 展望

目前在研究M.alpina生产PUFAs过程相关酶时所使用的体系尚不健全，今后的研究将会集中于选择较完善的表达系统。伴随着对M.alpina中涉及PUFAs合成相关酶的作用机理逐步清晰，构建具有目标导向的高山被孢霉基因工程菌对M.alpina在产功能性PUFAs的应用方面具有非常重要的意义。在此基础上利用天然碳源和氮源设计较为廉价的培养基进行M.alpina高产PUFAs的研究工作具有很大的实际意义，并为发展利用菌体生产菌饲料的研究提供有力保障。M.alpina生产ARA等不饱和脂肪酸在发酵条件探究和生产安全性上可行，加上人们对健康的日益重视，PUFAs的需求量必将进一步增加，甚至可能在短时间内激增，因而M.alpina发酵生产PUFAs具有广阔的市场前景。

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