田迎樱，胡世伟，薛长湖，李兆杰,*

（1青岛工学院食品工程学院 青岛 266003；2中国海洋大学食品科学与工程学院 青岛266003）

2型糖尿病患者占糖尿病患者总数的90%以上，目前认为，胰岛素抵抗是其主要的始发因素[1]。胰岛素抵抗是2型糖尿病的显著特征之一及最好的预测因子，因此，提高胰岛素的敏感性，减轻胰岛素抵抗已成为防治2型糖尿病及其并发症的重要手段[2]。

海参岩藻糖基化的硫酸软骨素（fucosylated chondroitin sulfate from sea cucumber,SC-CHS）是1种带有类岩藻糖支链的酸性黏多糖，且糖链上有部分羟基发生硫酸酯化。目前对SC-CHS活性的研究主要集中在抗凝血[3]、抗血栓[4]、抗肿瘤[5]等生物活性，其降血糖作用及改善胰岛素抵抗的的作用尚未见报道。冰岛刺参是1种低经济价值的海参，主要分布在大西洋北部，其产量大、营养价值较高、利用率较低。本文以冰岛刺参中岩藻糖基化的硫酸软骨素（fucosylated chondroitin sulfate from Cucumaria frondosa, Cf-CHS）为研究对象，研究其对2型糖尿病小鼠降血糖及对胰岛素抵抗的改善作用，为低值海参的高值化利用提供理论依据。

1 材料方法

1.1 材料与仪器

♂ C57BL/6J小鼠，SPF级，体质量17-19g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2009-0007。冰岛刺参购自青岛市南山水产品市场，由中国科学院海洋研究所廖玉麟研究员对其进行了种属鉴定。

干酪素、氯化胆碱、DL-蛋氨酸、氯化十六烷基吡啶（CPC）、罗格列酮、木瓜蛋白酶（5327U/mg）购自美国Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒，购自北京中生北控生物科技股份有限公司；胰岛素、脂联素、抵抗素、瘦素和TNF-α ELISA检测试剂盒，购自美国R&D公司；其它试剂均为国产分析纯。

GL-20M型高速冷冻离心机，上海卢湘离心机仪器有限公司产品；TDD5K型冷冻离心机，长沙东旺实验仪器有限公司产品；Model680型酶标仪，美国Bio RAD产品； ALPHA 1-4 LO型冻干机，德国CHRIST公司产品；LABOROTA 4 000型旋转蒸发仪，德国Heidolph产品。

1.2 实验方法

1.2.1 岩藻糖基化的海参硫酸软骨素制备

按照文献方法提取Cf-CHS[3]。将冰岛刺参干品粉碎，丙酮浸泡脱脂24h，晾干。向脱脂干海参中（以下提取步骤均按照1g 干物计算）加入木瓜蛋白酶100mg， 60℃水浴24h，上清液中加入1.6mL 10%的CPC溶液，室温下4000r/min离心15min。沉淀溶解于15mL 3mol·L-1NaCl∶乙醇（100∶15体积分数）溶液中，分两步使溶液醇度达到40%及75%，分别按上述离心，取乙醇浓度为75%的离心沉淀物，分别用30mL 80%和 95%乙醇先后洗2～3次。蒸馏水溶解沉淀物，用截流分子量为10,000u的透析袋室温下蒸馏水透析48h，每12h换水，浓缩，冻干，得粗Cf-CHS，检测纯Cf-CHS在粗品中的含量为85-90%。粗多糖过DEAE-52阴离子交换柱，以0～1.4mol·L-1NaCl连续梯度缓冲盐溶液进行洗脱，每7mL收集1管。洗脱液过液相TSK4 000柱子，检测组分单一的管，收集后透析，真空冷冻干燥，得Cf-CHS纯品。本课题组前期研究显示，Cf-CHS分子量为21.53ku，得率为4.03%，主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和海藻糖组成，且3种糖摩尔比为1∶1.14∶1.55[6]，其硫酸根含量占总糖的27.81%[7]。

1.2.2 动物分组及实验

用饲喂高脂高糖饲料的方法建立胰岛素抵抗小鼠模型。C57BL/6小鼠随机分为正常对照（标准饲料）、模型对照（HFSD）、阳性对照（HFSD+rosiglitazone (RSG), 1mg·(kg·d)-1）、Cf-CHS 组（HFSD+Cf-CHS, 80mg·(kg·d)-1）及 Cf-CHS+RSG 组（HFSD+Cf-CHS+RSG，80+1mg·(kg·d)-1）。各组动物饲料配制成分见表1。其中，复合矿物质及维生素均参照AIN-93配方。按照阿特沃特通用系数系统进行食物能量换算，正常组饲料热量为3.85 kcal·g-1，其它组饲料热量为4.85kcal·g-1。

小鼠自由摄食和饮水，每3d记录体质量及食量，连续喂养19周。末次喂养后，禁食不禁水 10h，摘眼球取血，常规分离血清，保存于-20℃备用。迅速剥离皮下脂肪、肾周脂肪、附睾脂肪，称重。

表1 动物饲料配方组成/g·kg-1Table 1 Compositions of animals’ experimental diets/g·kg-1

1.2.3 空腹血糖及葡萄糖耐量测定

小鼠禁食不禁水 5h，尾静脉取血，参照试剂盒方法测定空腹血糖水平。小鼠灌胃葡萄糖溶液（2g·kg-1），分别测定给葡萄糖后0、0.5和2h的血糖值，按式1计算血糖浓度-时间曲线下面积（area under the curve, AUC）：

1.2.4 血清胰岛素测定

小鼠禁食不禁水10h，摘眼球取血，常规分离血清，参照ELISA试剂盒方法测定，并按式2计算胰岛素抵抗指数（insulin resistance index, HOMA-IR）：

1.2.5 血清脂联素、抵抗素、瘦素及TNF-α测定

参照ELISA试剂盒方法测定。

1.3 数据统计处理

2 结果与分析

2.1 对小鼠体质量增量的影响

肥胖是2型糖尿病的重要诱发因素。60%以上的成年2型糖尿病患者在发病前存在肥胖，且肥胖程度与糖尿病的发病率成正相关。如表 2所示，模型对照组小鼠体质量增量明显高于正常对照组（p<0.01），而摄食量变化不显著。与模型对照组相比，Cf-CHS组和Cf-CHS+RSG小鼠体质量增量分别显著降低了14.16%和32.24%。与阳性对照组相比，Cf-CHS+RSG组小鼠体质量增量降低了10.20%。结果表明，Cf-CHS可以抑制小鼠体质量的增加，Cf-CHS与RSG复配使用，效果更佳。

表2 Cf-CHS对胰岛素抵抗小鼠体重增量及脂肪重量的影响（n=10, ±s）Table 2 Effects of Cf-CHS on body weight gain and adipose weight in type insulin resistant mice（n=10,±s）

表2 Cf-CHS对胰岛素抵抗小鼠体重增量及脂肪重量的影响（n=10, ±s）Table 2 Effects of Cf-CHS on body weight gain and adipose weight in type insulin resistant mice（n=10,±s）

注：##p<0.01 与正常组比; * p<0.05, ** p<0.01 与模型组比; ★p<0.05与阳性组比。Note: ## p<0.01 vs normal control; * p<0.05, ** p<0.01 vs model control; ★p<0.05 vs positive control group.

组别 摄入食量/g·d-1 体重增量/g 肾周脂肪/g 附睾脂肪/g 皮下脂肪/g 白色脂肪/g 体脂比/%正常对照 4.10±0.08 11.83±0.77 0.23±0.04 0.50±0.14 0.10±0.07 0.78±0.10 2.69±0.23模型对照 3.49±0.24 24.49±1.77 ## 0.62±0.12 ## 1.67±0.19 ## 0.54±0.08 ## 2.86±0.24 ## 6.98±0.64 ##阳性对照 3.43±0.20 18.43±0.86 ** 0.37±0.08** 0.90±0.16** 0.36±0.11* 1.50±0.16** 4.20±0.32**Cf-CHS 3.45±0.23 21.02±1.03 * 0.42±0.15* 1.14±0.11** 0.41±0.07* 1.91±0.17** 4.51±0.44**Cf-CHS+RSG 3.39±0.14 16.55±0.78 **★ 0.29±0.09**★ 0.54±0.10**★ 0.28±0.08** 1.02±0.17**★ 3.10±0.34**★

2.2 对脂肪积累的影响

如表2所示，模型对照组小鼠体内白色脂肪重量和体脂比显著高于正常对照组（p<0.01），说明高脂高糖饮食导致了脂肪的积累。摄食Cf-CHS后，与模型对照组比，Cf-CHS组小鼠白色脂肪重量和体脂比降低了33.22%和35.39%；与阳性对照组比，Cf-CHS+RSG组小鼠白色脂肪重量和体脂比显著降低（p<0.05）。结果提示 Cf-CHS能减少脂肪在体内的积累，且Cf-CHS与RSG复配使用优于Cf-CHS单用。

2.3 对空腹血糖及糖耐的影响

空腹血糖和葡萄糖耐受性是目前公认诊断糖尿病的标准。葡萄糖耐受性与AUC成反比。如表3及图1所示，模型对照组小鼠空腹血糖和AUC较正常对照组显著升高（p<0.01），表明模型对照组小鼠出现了高血糖症状，且糖耐水平已经受损。摄食Cf-CHS后，与模型对照组比，Cf-CHS组小鼠空腹血糖和AUC积显著下降了15.55%和13.87%；与阳性对照组比，Cf-CHS+RSG组小鼠 AUC显著下降了 11.70%，而空腹血糖水平变化不显著。结果提示Cf-CHS有一定的降血糖作用，且与RSG复配后效果更显著。

表3 Cf-CHS对胰岛素抵抗小鼠空腹血糖、血清胰岛素水平及胰岛素抵抗系数的影响（n=10, ±s）Table 3 Effects of Cf-CHS on fasting blood glucose and serum insulin levels in insulin resistant mice（n=10,±s）

表3 Cf-CHS对胰岛素抵抗小鼠空腹血糖、血清胰岛素水平及胰岛素抵抗系数的影响（n=10, ±s）Table 3 Effects of Cf-CHS on fasting blood glucose and serum insulin levels in insulin resistant mice（n=10,±s）

注：## p<0.01 与正常组比; * p<0.05, ** p<0.01 与模型组比; ★p<0.05与阳性组比。Note: ##p<0.01 vs normal control; *p<0.05, **p<0.01 vs model control; ★p<0.05 vs positive control group.

组别 空腹血糖/ mmol·L-1 血清胰岛素/ mU·L-1 HOMA-IR正常对照 9.28±1.40 10.82±0.32 4.53±0.31模型对照 13.12±0.82## 14.68±0.60## 8.22±0.95##阳性对照 10.92±0.69** 13.36±0.14* 5.79±2.62*Cf-CHS 11.08±0.85* 13.54±0.57* 5.66±2.05*Cf-CHS+RSG 10.14±0.67** 11.29±0.66**★ 4.93±1.55**

图1 Cf-CHS对胰岛素抵抗小鼠葡萄糖耐受量的影响（n=10,±s）## p<0.01 与正常组比; * p<0.05, ** p<0.01 与模型组比; ★p<0.05 与阳性组比.Fig.1 Effects of Cf-CHS on glucose tolerance in insulin resistant mice（n=10,±s）## p<0.01 vs normal control; * p<0.05, ** p<0.01 vs model control; ★p<0.05 vs positive control group.

2.4 对血清胰岛素水平的影响

高血糖和胰岛素抵抗是2型糖尿病的标志。在2型糖尿病早期，胰岛素水平越高，说明胰岛素抵抗程度越严重。HOMA-IR是用于评价个体的胰岛素抵抗水平的指标。由表3可知，高脂高糖饮食显著提高了模型对照组小鼠血清胰岛素水平和 HOMA-IR值（p<0.01），说明模型对照组出现了严重的胰岛素抵抗病变。与模型对照组比，Cf-CHS组小鼠血清胰岛素含量和HOMA-IR值分别降低了7.77%和31.14%；与阳性对照组相比，Cf-CHS+RSG组小鼠血清胰岛素水平显著降低了15.49%，而HOMA-IR值变化不显著。结果提示Cf-CHS能改善小鼠的胰岛素抵抗，与RSG复配后效果更显著。

2.5 对脂联素的影响

脂联素是脂肪细胞特异性分泌的蛋白质，血清脂联素浓度与胰岛素敏感性呈正相关，与机体胰岛素抵抗程度呈负相关。由表 4可知，与正常对照组比，模型组小鼠的血清脂联素水平显著降低（p<0.01）。经Cf-CHS干预后，与模型对照组比，Cf-CHS组脂联素水平提高了22.81%；与阳性对照组比，Cf-CHS+RSG组脂联素变化不显著。提示Cf-CHS能促进脂肪组织分泌脂联素，改善胰岛素抵抗。

表4 Cf-CHS对胰岛素抵抗小鼠血清脂联素、抵抗素、瘦素及TNF-α含量的影响（n=10, ±s）Table 4 Effects of Cf-CHS on serum adiponectin, resistin, leptin, and TNF-α levels in insulin resistant mice（n=10，±s）

表4 Cf-CHS对胰岛素抵抗小鼠血清脂联素、抵抗素、瘦素及TNF-α含量的影响（n=10, ±s）Table 4 Effects of Cf-CHS on serum adiponectin, resistin, leptin, and TNF-α levels in insulin resistant mice（n=10，±s）

注：## p<0.01 与正常组比; * p<0.05, ** p<0.01 与模型组比; ★p<0.05, ★★p<0.01与阳性组比。Note: ## p<0.01 vs normal control; * p<0.05, ** p<0.01 vs model control; ★p<0.05, ★★p<0.01 vs positive control group.

组别 脂联素/ng·mL-1 抵抗素/ng·mL-1 瘦素/ng·mL-1 TNF-α/pg·mL-1正常对照 205.40±9.73 5.57±0.10 0.147±0.007 57.03±1.37模型对照 110.20±18.08## 11.59±0.60## 0.316±0.026## 100.78±6.53##阳性对照 151.78±7.27** 8.43±0.18** 0.218±0.036* 77.40±3.15**Cf-CHS 135.34±9.67* 8.43±0.42** 0.192±0.025** 76.42±2.10*Cf-CHS+RSG 164.14±5.13** 7.07±0.51**★ 0.140±0.011**★★ 60.41±2.09**★

2.6 对抵抗素的影响

抵抗素是由脂肪细胞产生和分泌的特异性肽激素，作用于骨骼肌细胞、脂肪细胞等，能降低其对胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗。由表4可知，经Cf-CHS干预后，与模型对照组比，Cf-CHS组小鼠抵抗素含量显著降低了27.26%；与阳性对照组比，Cf-CHS+RSG组小鼠抵抗素含量显著降低（p<0.05）。提示，Cf-CHS能降低脂肪细胞分泌抵抗素的能力，改善胰岛素抵抗，与RSG复配后效果更显著。

2.7 对瘦素的影响

瘦素主要是由白色脂肪组织分泌的特异性蛋白质，能免抑制脂肪的合成，与胰岛素抵抗程度呈正相关。由表4可知，经Cf-CHS干预后，与模型对照组比，Cf-CHS组瘦素含量显著降低了39.24%；与阳性对照组比，Cf-CHS+RSG组小鼠瘦素含量显著降低（p<0.01）。提示Cf-CHS能抑制脂肪细胞对瘦素的合成，抑制胰岛素抵抗，与RSG复配后效果更显著。

2.8 对TNF-α 的影响

TNF-α能够抑制脂肪细胞合成，促进脂肪细胞分解，诱导产生瘦素，与胰岛素抵抗呈正相关。由表 4可知，饲喂Cf-CHS后，与模型对照组比，Cf-CHS组小鼠血清TNF-α水平显著降低了24.17%；与阳性对照组比，Cf-CHS+RSG组小鼠TNF-α含量显著降低（p<0.05）。提示Cf-CHS能抑制巨噬细胞产生TNF-α，改善胰岛素抵抗，且Cf-CHS能增强阳性药物RSG的作用。

3 讨论

本实验采用高脂高糖建立了胰岛素抵抗小鼠模型，研究了Cf-CHS降血糖及改善胰岛素抵抗作用。结果显示，Cf-CHS能显著减轻小鼠体质量及体脂比，降低空腹血糖水平，改善糖耐受损，抑制胰岛素抵抗，增加血清脂联素含量，降低血清抵抗素、瘦素和TNF-α含量。Cf-CHS与RSG复配后，除脂联素外，上述作用更显著。结果提示，Cf-CHS能改善2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗，且Cf-CHS与RSG具有协同作用。

近年来研究发现，脂肪组织具有分泌多种细胞因子的功能，可以调节糖脂代谢、胰岛素敏感性，参与糖尿病及相关疾病的发生发展。其中，脂联素、抵抗素、瘦素和 TNF-α等是与胰岛素抵抗相关的脂肪细胞因子。脂肪细胞对上述分泌产物过多或不足能够引起胰岛素抵抗。脂联素是与胰岛素抵抗程度呈负相关的细胞因子，在2型糖尿病患者体内低表达，其浓度随脂肪体积的增大而减少，作用机制可能与PI3K胰岛素信号通路的缺陷有关[8]。魏学娟等证明黄芪多糖能通过提高胰岛素抵抗大鼠血清脂联素含量起到增加胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗[9]。本实验中Cf-CHS显著提高了小鼠血清脂联素水平，降低了胰岛素抵抗程度。抵抗素、瘦素和TNF-α是与胰岛素抵抗程度正相关的脂肪细胞因子，在2型糖尿病患者体内高表达。高水平的抵抗素可以抑制胰岛素的分泌和功能，诱导产生高胰岛素血症并增强胰岛素抵抗。Sang WK 等发现银耳多糖能降低db/db小鼠血清抵抗素水平，促进其基因和蛋白的表达[10]。瘦素不仅能削弱胰岛素的生物效应，而且能通过抑制脂肪分解降低肌肉对胰岛素的敏感性，从而出现胰岛素抵抗，另一方面，瘦素对胰岛素的分泌及其敏感性产生负反馈调节。金智生等证明红芪多糖能降低高脂高糖诱导的胰岛素抵抗大鼠的血清及脂肪中瘦素的含量，改善胰岛素抵抗[11]。TNF-a与血清胰岛素水平、葡萄糖代谢及脂质代谢密切相关，高水平的TNF-a能抑制胰岛素的功能，诱导高胰岛素血症。Ji-Hye K等发现辣椒素能降低2型糖尿病小鼠脂肪组织中TNF-α表达，提高胰岛素敏感性并改善胰岛素抵抗[12]。本实验中Cf-CHS显著降低了2型粮尿病小鼠的血清抵抗素、瘦素和TNF-α含量，改善了胰岛素抵抗；Cf-CHS与RSG复配使血清抵抗素、瘦素和TNF-α的浓度降低更显著。提示Cf-CHS能通过增加血清脂联素浓度及降低血清抵抗素、瘦素和TNF-α的水平，改善胰岛素抵抗。

RSG是1种噻烷二唑酮类降血糖药物，是1类选择性PPAR-γ配体，作为一类胰岛素敏感剂发挥作用[13]。RSG降血糖及改善胰岛素抵抗的活性已有广泛的报道[14]，然而也伴随有一系列的副作用[15]。在美国及欧洲，RSG的使用已量显著减少，且被建议避免单独用于 2型糖尿病和胰岛素抵抗的治疗[16]。周燕等证明罗格列酮能降低胰岛素抵抗个体中血清和脂肪组织中抵抗素和瘦素含量[17]。邓宏明等证明罗格列酮增加胰岛素抵抗患者血清脂联素水平，并降低TNF-α水平[18]。本实验中，与阳性对照组相比，Cf-CHS与RSG复配使用进一步显著降低了血糖水平，改善了小鼠的胰岛素抵抗及调节血清中脂肪细胞因子的水平。说明Cf-CHS与RSG具有协同效应，能进一步降低胰岛素抵抗程度。提示对胰岛素抵抗的治疗，可以通过摄入Cf-CHS降低RSG的用量。

综上所述，Cf-CHS能通过促进脂肪细胞对脂联素的分泌，抑制抵抗素、瘦素和TNF-α的分泌，改善胰岛素抵抗。其进一步作用机制尚待深入研究。

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