李艳平

（吉林农业工程职业技术学院,吉林四平 136000）

我国是世界上水产品产量最大的国家之一，淡水鱼资源丰富，黑鱼作为淡水鱼，具有营养丰富，蛋白质含量高等特点。但黑鱼肉较粗，不是太好吃，将黑鱼蛋白水解是解决黑鱼肉粗，口感差的一种新的途径。将黑鱼蛋白酶解制备黑鱼多肽，既提高营养价值，也有一定的功能特性。生物活性肽已被证实具有降胆固醇[1]、降血压[2]、抑菌[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、免疫调节[6]、促进有益微量元素及营养素吸收[7]等功效。本试验以黑鱼肉蛋白为原料，进行黑鱼肉酶解工艺参数的最佳条件研究，一般认为影响酶解效果的因素有7个：底物浓度、pH、温度、时间、酶用量、抑制剂、激活剂。抑制剂、激活剂既影响酶解速度又会引入不确定的因素，出于成本及食品安全性的考虑，不对这两个影响因素进行讨论。目前利用淡水鱼酶解制备多肽研究的不少，但利用淡水鱼中的黑鱼为原料进行酶解制备功能性食品的研究基本没有，因此最佳的酶解工艺能促进黑鱼深加工的发展，提高经济效益。本课题主要研究黑鱼蛋白酶解最佳工艺参数，为黑鱼蛋白肽抗氧化特性验证提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑鱼 四平地直市场鲜活黑鱼；硫酸锂、钨酸钠、钼酸钠、三氯乙酸 分析纯；酪氨酸、酪蛋白 生化试剂；硫酸锂AR、钨酸钠AR、钼酸钠AR、酪蛋白、酪氨酸、三氯乙酸AR、中性蛋白酶(ASI.398)、复合蛋白酶(Protamex)诺维信天津公司；木瓜蛋白酶(Papain)、碱性蛋白酶(Alcalase)北京奥博星生物技术有限责任公司；各酶水解参数见表1。

电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；722型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；PHS-3C型数字酸度pH计 上海楚定分析仪器有限公司；78-1磁力加热搅拌器 武汉莱莫检测设备有限公司；温度计 天津市天马仪器厂；恒温水浴锅 江苏省金坛市江南仪器厂；TDL一80一ZB型离心机 上海安亭科学仪器厂。

表1 各酶水解参数Table1 The hydrolysis parameter of several protease

1.2 试验方法

1.2.1 黑鱼前处理

将新鲜的黑鱼洗净，去头、尾、内脏后，分别取皮、背部、腹部、两侧红肉和白肉，用捣碎机将其捣碎成均匀的糜状，然后分别用保鲜袋包装，放到冰箱冰冻备用[8]。

1.2.2 黑鱼蛋白酶解工艺

参照Quaglia,G.B.等人[4]对沙丁鱼的酶解方法并做部分修改。具体酶解过程如下：取冷冻的黑鱼精肉切块前解冻，然后破碎进行脱脂处理，将鱼肉与异丙醇1：1（V：V）在46℃循环浸提 1h，浸提后将样品置于通风处除去并挥发剩余的异丙醇，加水匀浆形成鱼糜液，再按[E]/[S]=1%鱼糜液的用量加入蛋白酶,蛋白酶在pH8，温度50℃下搅拌水解至一定时间，将酶解液放到沸水浴中加热使酶失去活性，冷却，然后以4000r/min的转速离心10min。上清液即为黑鱼酶解液。

1.2.3 酸溶性多肽含量的测定

采用TCA-SN 指数法，其定义为：在特定条件下三氯乙酸(TCA)水溶液中可溶性氮的物质的量的分数；常采用的是10%的三氯乙酸。TCA-SN指数反映了水解产物的溶解性能；同时，也表明了水解产物物质的量的分布；在一定程度上是蛋白质水解程度的一种表征。

式中，C：上清液中蛋白质的浓度，mg/mL；

V：10%TCA的总体积，mL；

W：蛋白质样品的质量，g。

1.2.4 由酸溶性多肽含量确定最佳用酶和最适酶解时间

不同蛋白酶有不同特异酶切位点，因而蛋白酶选择是制备生物活性肽过程中一个重要环节。本试验研究的目的是黑鱼蛋白通过限制性酶解后，尽可能获得肽类产物，而不是氨基酸，因此，肽提取率的高低成了评定水解效果的最主要标准。在以酸溶性多肽确定所选最佳酶试验中，所选用各种蛋白酶，都在各酶的理论的最适条件下反应，酶解的温度为各种酶的最适温度，酶解的pH值为最适pH值，为保证各种酶对黑鱼蛋白水解能力的可比性，加酶量均为[E]/[S]=1%，酶解时间5h，主要研究黑鱼蛋白水解过程中，不同的蛋白酶水解液的肽提取率随着水解时间延长的变化趋势。

1.2.5 碱性蛋白酶最佳作用条件研究方法

1.2.5.1 单因素对黑鱼蛋白水解的影响

不同pH值对水解效果的影响：取黑鱼鱼糜3份，每份重40克，加水调料液使底物浓度[S]为1%(w/v)，调pH值为8、9、10时，按照[E]/[S]为1%的加酶量分别加碱性蛋白酶，混匀，在其最适温度下水解4h，沸水浴灭酶活。测多肽含量。

反应温度对水解效果的影响：取黑鱼鱼糜3份，每份重40克，加水调料液使底物浓度[S]为1%(w/v)，pH自然，按照[E]/[S]为1%的加酶量分别加碱性蛋白酶，混匀，在温度分别为45、50、55℃下水解4h，沸水浴灭酶活。测多肽含量。

加酶量对水解效果的影响：取黑鱼鱼糜3份，每份重40克，加水调料液使底物浓度[S]为1%(w/v)，调pH9。分别加入1.5%、1.0%、2.0%的蛋白酶，最适温度下水解4h后，测多肽含量。

底物浓度对碱性蛋白酶酶解的影响：取黑鱼鱼糜3份，每份重40克，加水调料液使底物浓度[S]分别为1.0%、1.5%、2.0%，调pH9。按照[E]/[S]为1%的加酶量分别加碱性蛋白酶，混匀，其最适温度下水解4h。测多肽含量。

1.2.5.2 采用正交试验研究了水解温度、加酶量、料液比、起始pH对多肽含量的影响

根据以上试验结果，最适水解时间为4h，以反应温度、加酶量、底物浓度与起始pH为试验因子，以多肽含量指标，进行了L9( 34)正交试验，因素水平如表2。

表2 正交试验方案设计表Table 2 L9 ( 34 )Factor and Level

2 结果与讨论

2.1 由酸溶性多肽含量确定的最佳用酶和最适水解时间

在各酶的最适宜条件下测得的多肽含量如图1所示.

图1 不同蛋白酶水解黑鱼的多肽含量曲线Fig.1 Curve of TCA-SN in process of different proteinase hydrolysis Snakehead Protein

由图1可知，碱性蛋白酶酶解的多肽含量最高，5h时的含量为28.56%；中性酶酶解多肽含量最低，从图中可看出，前4h的多肽含量增幅较快，4h后变化缓慢。为了节约时间，所以水解最佳酶解时间确定为 4h。多肽含量除了与蛋白酶种类不同外，它也受酶解的温度和底物浓度等的影响。

2.2 单因素试验对碱性蛋白酶酶解影响

2.2.1 不同pH对碱性蛋白酶酶解反应的影响

碱性蛋白酶有其最适的pH，pH过大或过小，底物和酶分子的带电状态就会改变，就会导致酶的活力降低[9]，不同pH在水解4h后对多肽含量的影响如图2所示。

图2 不同pH对酶解产物多肽含量的影响Fig. 2 Effect of different pH on DH in process of alkaline protease hydrolysis

由图2可知，随着起始pH的增加，多肽含量呈现由最初的增幅快到慢的趋势。由于酶分子是一种特殊的蛋白质分子，活性部位较多，酶的活性部位由结合点和催化位点组成，结合部位和催化部位对反应体系的pH值变化敏感，解离状态也随pH值变化而变化，pH过高过低对酶解都有不利的影响。因此确定pH9时多肽含量最高为碱性蛋白酶最适pH。

2.2.2 不同温度对酶解产物多肽含量的影响

每种蛋白酶有其各自的水解的最适水解温度，但最适温度也是随着水解蛋白底物的性质的改变而变化，并不是对于所有的蛋白底物其最适水解温度都一样。不同温度对酶解产物多肽含量的影响如图3所示。

图3 不同温度对多肽含量的影响Fig.3 Effect of different temperature on DH in process of alkaline protease hydrolysis

从图3可看出，用碱性蛋白酶酶解黑鱼时，酶解产物多肽含量开始也是随着温度的升高而增大，当水解时间为4h时，水解温度为50℃时的多肽含量最高，而水解温度为55℃时，2h后多肽含量增大缓慢，温度过高，酶解位点被隐藏，也影响酶的作用效果，温度过高还会使底物蛋白发生变性。确定碱性蛋白酶水解的最适温度为50℃。

2.2.3 不同加酶量对酶解产物多肽含量的影响

碱性蛋白酶在使用过程中依据应用说明书有一个基本推荐用量，但是各种蛋白酶的合适量跟最适水解温度一样，也是随着水解蛋白底物的性质的改变而变化，一般情况下酶用量增加会提高酶解效率，而且酶用量稍微大些对于水解反应本身是没有不良效果，但是酶用量一旦大于最适浓度，效果不会太明显，可能还会引起酶自溶增强[10]，酶用得多使用成本就高，因此应当根据底物的情况来确定其合适的用量，即酶用量也存在一个所谓的“经济浓度”。因此，本试验的目的是研究碱性蛋白酶以黑鱼蛋白为作用底物时的合适用量。试验结果如图4所示。

图4 不同加酶量对多肽含量的影响Fig.4 Effect of different enzyme loading on the TCA-SN

由图4可看出，多肽含量是随着酶添加量的增加而增大，但当酶添加量超过1.5%时，多肽含量上升缓慢，酶添加量为1.5%的多肽含量与酶添加量2%的多肽含量相差不多，由于酶价格高，因此从经济成本出发，选酶用量为1.5%的最合适。

2.2.4 不同底物浓度对酶解多肽含量的影响

不同蛋白酶其活性也受底物浓度的影响，碱性蛋白酶酶解体系也有其最合适的底物黑鱼蛋白初始浓度，本试验就是测定在取得最高多肽利率的情况下，底物浓度的最适值。试验结果如图5。

图5 不同底物浓度对多肽含量的影响Fig. 5 Different effects of substrate on the impact of TCA-SN

由图5可知，底物浓度为1.5%的多肽含量随水解时间延长增加速度快，底物浓度高于1.5%的当达到一个最大值后增长缓慢，原因是酶催化能力达到极限，鱼溶液中不存在有活性游离的酶，所有活性酶都与底物结合，过高的底物浓度抑制水解反应的顺利进行，也会导致后续的处理过程中将浪费更多的资源。浓度太低导致蛋白酶和作用底物两者的碰撞机率太少，因此依据图5，选择底物浓度1.5%最为合适。

2.3 正交试验结果

由于本试验的主要考核指标是多肽含量，所以以多肽含量为指标做正交试验。表3以多肽含量TCA-SN(%)为指标的正交试验结果。

表3 最佳水解条件的正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3可知，在水解时间为4h的前提下，以多肽含量为考核指标，影响试验结果的主次因素为D→B→A→C，最优组合为A1B2C3D2。即水解温度50℃，加酶量1.5%，底物浓度2%，起始pH9。在此条件下做验证试验，结果表明多肽含量为29.5%,高于正交试验所列出的任何一组，所以选用这个组合条件为最佳条件。

3 结论

本文主要研究了黑鱼肉酶解的单因素试验，单因素试验表明用碱性蛋白酶酶解黑鱼，酶解的条件是水解温度50℃，加酶量1.5%，底物浓度1.5%，起始pH9，以此为依据设计了正交试验，对酶解工艺进行优化，正交试验结果表明：碱性蛋白酶酶解黑鱼最佳条件是底物浓度1.5%，起始pH9，温度50℃，加酶量1.5%，在此条件下验证试验中用碱性蛋白酶酶解黑鱼蛋白，酶解后的多肽含量为29.5%。

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