张智，于震，王振宇,2*，邓心蕊，刘冉，张巧俏

（1 东北林业大学林学院， 哈尔滨150040；）

（2 哈尔滨工业大学食品科学与工程学院， 哈尔滨150090）

植物多酚具有多元酚结构，又称植物单宁，在蔬菜、水果谷物豆类等植物中广泛分布，是植物体内重要的次级代谢产物[1]。多酚具有多种生理功能，可以起到抗氧化、抗肿瘤、防治冠心病与中风等作用，且有明显的护肝益肾功效[2]。落叶松为松科落叶松属的落叶乔木，广泛分布于我国东北、内蒙古地区，资源丰富。研究表明，松科植物体内含有天然活性较高的大量多酚物质，其含量是苹果的13倍以上[3]。松多酚具有较强的抗氧化性，在食品领域中可以作为天然的防腐剂与抗氧化剂，与人工合成的添加剂相比有明显的优势[4]。因此，为最大限度发挥多酚物质的特点，有必要对落叶松的多酚类物质进行优化。大孔树脂吸附法工艺流程比较简单，操作容易，安全高效，是较理想的纯化方法[5]。本文采用大孔树脂层析法纯化落叶松多酚，并用响应面法优化纯化工艺，为落叶松多酚的综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

落叶松树皮 选自长白山地区，光照晒干后粉碎过40目筛，待用；大孔树脂 AB-8、X-5、D101、NKA-9、D4020、S-8 天津海光试剂公司；其他试剂均为国产分析纯。

中草药粉碎机 天津市泰斯特有限责任公司；722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司制造；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；Agilent 1260高效液相分析仪 美国安捷伦科技有限公司；层析柱（20mm×700mm）。

1.2 多酚溶液的制备

取一定质量的落叶松树皮粉末，按1:20的料液比加入浓度为50%的乙醇，于水温为50℃的恒温水浴锅中静置2.5h。浸提2次，抽滤，合并滤液，旋蒸滤液以除去多余的乙醇溶剂，用蒸馏水定容至100mL，根据GB/T 8313-2008测定溶液的多酚含量[6]。用蒸馏水稀释至所需浓度，置于冰箱中，待用。

1.3 大孔树脂的预处理

用95%乙醇浸泡树脂24h，充分溶胀树脂。换用蒸馏水清洗树脂，直至加适量水于上清液中无浑浊为止。再用质量分数为5%的稀盐酸溶液浸泡12h，用蒸馏水洗至中性。最后用质量分数为5%的氢氧化钠溶液浸泡12h，用蒸馏水洗至中性，置于阴凉避光处，备用。

1.4 大孔树脂的静态吸附与解析

将2.0g用滤纸擦干的树脂置于100mL锥形瓶中，加入2.5mg/mL的落叶松多酚粗提液50mL，置于摇床上震荡10h，按下式计算吸附量。

其中，Q为吸附量（mg/g）；A为吸附率（%）；C0为起始浓度（mg/mL）；C1为平衡浓度（mg/mL）；V为多酚溶液的体积（mL）；M为树脂质量（g）。

静态吸附结束后，抽滤，取1.5g充分吸收多酚的树脂，用蒸馏水冲洗至表面无残留溶液。再用滤纸擦干，置于100mL锥形瓶中，加入50%乙醇40mL，置于摇床上震荡10h，按下式计算解析量与解析率。

式中，D为解析量（mg/g）；E为解析率（%）；C2为平衡浓度（mg/mL）；V’为解析液体积（mL）；M为树脂质量（g）。

1.5 大孔树脂的动态吸附与解析

采用湿法装柱方法，先在层析柱的底端预先加进一部分蒸馏水，然后在层析柱口沿玻璃棒缓慢注入树脂至所需径长比。排出层析柱内的水至与树脂高度相齐，缓慢加入一定浓度多酚提取液。吸附6h，用2倍柱体积的蒸馏水清洗柱子，去除可溶性杂质。加入2倍柱体积的相应浓度乙醇洗柱，用500mL锥形瓶回收全部洗液，旋蒸，测定多酚浓度，计算回收率。参考李波等实验方法[7]，于45℃烘干后复溶，再次测定多酚浓度，计算纯度。

式中，R为回收率（%）；P为纯度（%）；C’1为回收液的浓度（mg/mL）；V’1为回收液的体积（mL）；C’0为进样液浓度（mg/mL）；V’0为进样液体积（mL）；C’2为复溶后多酚溶液的浓度（mg/mL）；V’2为复溶后溶液的体积（mL）；M’为烘干后粗多酚的质量（g）。

1.6 响应面优化落叶松多酚的纯化工艺

依据单因素实验的结果，选取上样浓度、上样体积与洗脱浓度 3个因素通过Design-expert8.05软件利用Box-Benhnken中心组合方法设计三因素三水平的响应面优化实验，并据此建立数学回归模型，做响应面分析。响应面优化因素水平设计表如表1所示。

表1 相应面试验因素与水平Table1 Factors and the levels of experiment of Response Surface

1.7 多酚纯化液的高效液相分析

以优化了的落叶松多酚纯化条件为依据，富集样液，用旋转蒸发仪浓缩至浓度为15.5mg/mL左右，在0.45μ m有机滤膜中过滤溶液2～3次，收集滤液备用。

高效液相色谱仪型号为Agilent 1260，选大连产型号为“依利特SinoChrom DS-BP”作为色谱柱。选择欧阳乐等优化的色谱条件[8]：流动相为甲醇-水（0.05%TFA），流速为1.0mL/min，波长为280nm，柱温为30℃，进样量为5µL。

2 结果与分析

2.1 树脂筛选结果

多酚的吸附与解析效果因树脂型号的不同而不同，表2显示了6种树脂对落叶松树皮多酚的吸附量、吸附率与解析率情况。

表2 6种树脂对多酚的静态吸附与解析性能Table2 Absorption and desorption capabilities of 6 kinds of macroretieular resins to polyphenols

由表2可知，X-5的吸附率是六种树脂中最高的，D101的解析率最高。D101的解析率比X-5略高，而吸附率与X-5相差很大。本实验以吸附率为主要考察因素，综合考虑，故选X-5作为多酚纯化的树脂。

2.2 纯化工艺单因素试验

2.2.1 径长比对多酚纯化的影响

图1反映了径长比对多酚纯化的影响情况。随着径长比的增加，落叶松多酚的回收率和纯度都在不断增加并趋于平衡。由此可知，径长比的增加有利于多酚的纯化效果，考虑到节省原料的因素，选1:25为落叶松多酚纯化过程中的最佳径长比。

图1 径长比对多酚纯化的影响Fig.1 Effect of fineness ratio on purity of polyphenols

2.2.2 洗脱浓度对多酚纯化的影响 如图2所示，随着乙醇浓度的增大，落叶松多酚的回收率以先快后慢的速度逐渐增大，乙醇浓度在 60%以后逐渐趋于平衡；多酚纯度呈现出先缓慢增加后下降的趋势，乙醇浓度为 50%时多酚纯度达到最大值。这可能是由于高浓度的乙醇可以溶解多种有机物，使多酚的杂质含量增加而导致纯度下降。以多酚纯度为主要考察因素，选择50%的乙醇作为最佳洗脱浓度。

图2 乙醇浓度对多酚纯化的影响Fig.2 Effect of elution concentration on purity of polyphenols

2.2.3 进样浓度对多酚纯化的影响 一般来说，上样浓度越低越有利于吸附[9]。然而，过低的浓度会减少溶质与树脂的接触机会，吸附效果不好。如图3所示，当进样浓度为2.5mg/mL时，回收率和纯度都达到最大值，分别为85.53%与75.88%。当进样浓度超过2.5mg/mL后，回收率和纯度开始下降。因此，选择2.5mg/mL作为最佳进样浓度。

图3 进样浓度对多酚纯化的影响Fig.3 Effect of sample concentration on purity of polyphenols

2.2.4 洗脱流速对多酚纯化的影响 过快的洗脱流速会延长解析带，使拖尾现象严重，而过低的流速会延长生产周期[10]。由图 4可知，多酚的回收率随着洗脱流速的增加而不断下降，多酚的纯度先上升后下降，在流速为5mL/min时达到最大值，最大值为76.68%。4mL/min与5mL/min对纯度影响不大，故将5mL/min作为最佳洗脱浓度。

图4 洗脱流速对多酚纯化的影响Fig.4 Effect of eluting speed on purity of polyphenols

2.2.5 进样体积对多酚纯化的影响 由图5可知，落叶松多酚的回收率随着进样体积的增加而不断下降，这可能是因为进样体积的不断增加打破了树脂对多酚的吸附平衡，使多余的多酚提取液漏出的缘故。多酚的纯度呈现出先上升后下降的趋势，在进样体积为40mL时达到最大值，最大值为75.79%。选择40mL为最佳上样体积。

图5 进样体积对多酚纯化的影响Fig.5 Effect of sample volume on purity of polyphenols

2.2.6 pH对多酚纯化的影响 pH对落叶松多酚的纯化效果影响如图6所示。落叶松多酚的回收率与纯度随pH的变化情况基本一致，均是先缓慢上升然后急速下降。碱性越强则回收率与纯化效果越差，这是因为多酚类物质含有多个苯羟基，在溶液中呈弱酸性，碱性溶液破坏了多酚苯羟基结构的因素所致。由图6可知，未经pH调节的多酚提取液纯化效果最好，所以没有必要调节粗提物。

图6 pH对多酚纯化效果的影响Fig.6 Effect of pH on purity of polyphenols

2.3 纯化工艺响应面优化试验

2.3.1 响应面试验方案与结果 依据单因素实验结果利用Box-Benhnken中心组合方法设计响应面实验方案，以多酚纯度为响应值，实验设计如表3所示。使用Minitab16回归拟合所得实验数据，得到回归方程：Y=75.27－2.33A－0.37B＋0.67C＋0.15AB＋0.2AC＋0.22BC－3.9A2－2.68B2－1.96C2。

表3 响应面试验方案与结果Table3 Experiment design and estimated values of response surface

2.3.4 响应面试验各因素的方差分析 对上述模型方程进行方差分析，各因素的方差分析结果如表 4所示。由该表数据可知，此模型是显著的（p<0.05）。失拟性值其 Frob>F值为0.0608(p>0.05)，说明该模型的拟合度较好。

乙醇浓度对落叶松多酚纯化工艺的影响最大，其Frob>F值为0.0067（<0.01），达到了极显著水平。各因素对结果的影响按大小排序依次为A（乙醇浓度）、C（进样体积）、和B（上样浓度），其Prob>F值分别为0.0067、0.2595和0.5150。

由表 4可知，各因素之间的交互作用对多酚纯化工艺影响不大。乙醇浓度的二次形式对纯化工艺影响很大，其Prob>F值为0.0039，达到了极显著水平。上样浓度的二次形式影响较大，Prob>F值为0.0177，达到了显著水平。图7～图9直观地反映了各因素之间的交互作用及其对响应值的影响。

图7至图9是响应值多酚纯度对各因素构成的三维空间曲面图，曲面图下面的等高线图可直观地反映各因素之间的交互作用。圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆表示二因素交互作用显著[11]，由此可知本实验的两因素交互作用不显著，这与通过软件得出的回归模型系数显著性检验得出的结果一致。

表4 响应面各因素的方差分析Table4 Variance analysis of factors of response surface

图7 洗脱浓度与进样浓度对多酚纯化工艺影响的响应面图Fig.7 Response surface graph of elution concentration and sample concentration to purification process of polyphenols

图8 洗脱浓度与上样体积对多酚纯化工艺影响的响应面图Fig.8 Response surface graph of elution concentration and sample volume to purification process of polyphenols

图9 进样浓度与上样体积对多酚纯化工艺影响的响应面图Fig.9 Response surface graph of sample concentration and sample volume to purification process of polyphenols

解多酚纯度的二次多项数学模型的逆矩阵，可知多酚纯度最大可达 75.68%。此时，洗脱浓度为47.03%，上样浓度为 2.46mg/mL，进样体积为 41.51mL。为简化实际操作，确定落叶松多酚纯化的最佳条件是：乙醇浓度 47%、进样浓度 2.5mg/mL、上样体积 42mL。在此简化条件下用软件求解方程可得到多酚纯度的预测值 75.66%。为了验证该结果，做一组该条件下多酚纯度的平行实验，取三个平行实验结果的平均值，得到的结果为 75.52%，该值接近预测值，证明可以用此模型纯化落叶松多酚。

2.4 多酚纯化液的高效液相分析

图10显示了在给定条件下落叶松树皮多酚的分离情况与7种多酚标准品的出峰时间。其中，没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸与芦丁的出峰时间分别为9.125、23.414、27.686、29.07、52.451min。

图10 多酚混合标准样品的高效液相色谱图及落叶松树皮多酚样品图Fig10 Chromatogram of polyphenols standard sample and Larch Pine Bark

由图可知，此条件下多酚的分离效果较好。采用《计算机辅助相似性评价系统》与标准样品图谱进行比对，计算图谱间的相似度，共确定了5个标准样品，分别是没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸与芦丁。由于条件有限，还有许多物质需要进一步测定。

3 结论

本实验以吸附率为主要指标，确定了 X-5为多酚纯化工艺使用的树脂。通过单因素试验确定了影响多酚纯化效果各个因素的最佳值。在此基础上，选取洗脱浓度、上样浓度、进样体积3个指标设计响应面优化试验，由Design-expert8.05软件处理数据得到纯化的最佳工艺条件为：径长比1:25，洗脱浓度47.03%，上样浓度2.46mg/mL，洗脱流速5mL/min，进样体积为41.52mL，pH6.85。考虑到实际操作需要，确定最终的工艺条件为：径长比1:25、洗脱流速5mL/min、乙醇浓度47%、进样浓度2.5mg/mL、上样体积42mL，在此条件下进行验证实验得到的纯化结果为75.52%，接近预测值75.66%。

分析多酚纯化液可知，落叶松树皮含有5种多酚，分别是没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡馆与芦丁。此结果可以给以后落叶松多酚纯化方面的研究提供一定的依据。

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