赵贵丽，罗爱平*，廖娅凡，吴红满，杨洁，宋志敏

（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025)

黄浆水主要来自热豆浆凝固、制坯压榨出来的泔水。黄浆水中含有丰富的营养物质及多种对人体健康有特殊功能作用的生理活性物质，如大豆异黄酮等[1-5]。但黄浆水中有机物含量低，培养所得生物量和产酸量有限，因此，需要加入一定量的营养物质以提高其生物量和产酸量[6]。面粉、糯米粉、大米粉、玉米粉不仅含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂肪等有机物，还含有矿物元素及维生素等营养物质，具有较高的营养价值，且来源广泛，价格便宜，故利用这些天然促生因子与黄浆水有机结合、营养互补来满足微生物的正常生长繁殖[7-10]。研究通过添加天然促生因子促使黄浆水自然发酵产酸。在单因素试验的基础上，选出最佳天然促生因子，采用均匀试验设计优化发酵条件及最佳天然促生因子添加量，研制一种豆腐天然凝固剂。不仅满足人们在饮食方面追求“绿色”、追求“天然”的理念，也减轻企业治污和推动社会效应，增加大豆加工附加值[11-14]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜黄浆水：将大豆进行精选、除杂、清洗后，用三倍于大豆（重量比）的自来水于室温（25-28℃）下浸泡8-10h，沥干后，用8倍于大豆干重的自来水于磨浆机进行磨浆，将所得豆浆用120目滤布进行过滤，并将滤出豆浆加热至95℃，保持5min。待豆浆冷却到80℃，量取1000mL熟豆浆于不锈钢盆中，将盆放入80℃的恒温水浴中，然后将30mL0.5M的氯化镁溶液，缓慢加入熟豆浆中，并轻轻搅拌，直至豆浆凝固物出现停止搅拌，保温静置20min后破脑压制得到的黄浆水；贵州中意食品有限责任公司提供。 面粉（80粉）、糯米粉、大米粉、玉米粉，购于贵阳市花溪区合力超市。 葡萄糖：购于保龄宝生物股份有限公司。氢氧化钠等：分析纯，重庆茂业化学试剂有限公司。

LRH系列生化培养箱 上海—恒科技有限公司；CS202B型电热保温干燥箱 重庆实验设备厂；SZ-96型自动纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂；PHS-3C酸度计 上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液的制备 新鲜黄浆水中加入4 %（w/v）的葡萄糖，调整初始pH为 6.2，37 ℃自然发酵24 h，即为种子液，备用。1.2.2单因素试验设计

1.2.2.1 天然促生因子的筛选 在黄浆水中分别添加4%（w/v）的面粉 、玉米粉 、糯米粉、大米粉，80 ℃水浴5min进行糊化，待冷却后，调整初始pH 6.2，接种6%（v/v）种子液，37 ℃培养24 h，并以常用碳源葡萄糖及空白为对照，以产酸量和pH为考察指标，筛选最佳促黄浆水自然发酵的天然促生因子。

1.2.2.2 发酵条件的筛选 固定发酵温度37℃、接种量6%（v/v）、最佳天然促生因子添加量4%（w/v）、发酵时间24h、培养基初始pH 6.2。在其它条件不变的前提下，分别改变发酵温度27、30、34、37、42℃，接种量3%、6%、9%、12%、15%，最佳天然促生因子添加量0%、2%、4%、6%、8%、10%，发酵时间24、48、72、96、120h，以产酸量、pH为指标，考察四因素对黄浆水自然发酵的影响。

1.2.3 均匀试验设计 根据单因素试验结果，对黄浆水自然发酵条件进行优化。以发酵温度（X1）、接种量（X2）、发酵时间（X3）、最佳天然促生因子添加量（X4）四个因素为自变量，以产酸量为Y，利用DPS软件设计4因素5水平10个试验处理的U10（54）均匀试验[15-17]，因素水平见表1。

表1 U10（54）均匀设计因素及水平表Table 1 U10（54）Variables and levels in the uniform design

1.2.4 测定指标 产酸量的测定[18]:取5mL发酵液至250mL的三角瓶中，加入25 mL蒸馏水，再加2滴0.1%的酚酞，摇匀，用0.0l mol/L的NaOH标准溶液滴定至微红色，30s不褪色即为终点。

式中：C- NaOH 标准溶液的浓度(mol/L)； V-滴定待测样消耗 NaOH标准溶液的体积(mL)；V0-滴定原样消耗的NaOH标准溶液的体积(mL)； m-取样量(mL)； K-酸换算系数，用乳酸表示，K=0.090。

pH：采用PHS-3C酸度计测定。

1.2.5 数据处理 每个指标重复测定3次。采用统计分析软件IBM SPSS Statistics v19.0.0进行显著性分析。折线图采用OriginPro 8.5绘图软件绘制。均匀试验数据采用DPS软件进行二次多项式逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同天然促生因子对黄浆水自然发酵的影响

图1 天然促生因子对黄浆水自然发酵的影响Fig. 1 The result of different natural growth-promoting factors to ferment yellow serofluid

图1可知，空白组pH为4.01，葡萄糖组pH为3.58，面粉组pH为3.45，故在黄浆水中添加面粉时pH最低，即酸性最强。

黄浆水中添加面粉的产酸量最高为0.6251g/100mL，是葡萄糖组0.5742g/100mL的1.09倍，是空白组0.3042g/100mL的2.05倍。表明添加面粉能较好的促进黄浆水发酵产酸，产酸量显著高于其余各组（p<0.05），故面粉为最佳天然促生因子。结果表明，黄浆水中添加面粉时产酸量最高，pH最低，且其来源广泛，价格便宜，故面粉为最佳天然促生因子。

2.1.2 不同面粉添加量对黄浆水自然发酵的影响

图2 面粉添加量对黄浆水自然发酵的影响Fig. 2 The result of different additive amount of flour to ferment yellow serofluid

由图2可知，未添加面粉时，pH达最大值，产酸量达最小值；当面粉添加量为8%时，pH达到最低值，产酸量达最高值。

当面粉添加量由0升至2%时，产酸量显著上升，表明添加面粉能够促进黄浆水发酵产酸；面粉添加量为8%时，产酸量达到最大为0.7545g/100mL是未添加面粉组最小值0.3042g/100mL的2.48倍；当面粉添加量为8～10%时，产酸量呈下降趋势，这是因为随着面粉添加量增加，产酸菌生长速度加快，产酸量增加，使环境pH下降，抑制菌体的生长。同时当面粉添加量到一定浓度时，环境的渗透压增加，使菌体生长受到抑制甚至不能忍受高渗环境死亡。结果表明：添加面粉对黄浆水发酵产酸影响显著（p<0.05）；面粉添加量以8%为宜。

2.1.3 不同发酵温度对黄浆水自然发酵的影响

图3 发酵温度对黄浆水自然发酵的影响Fig. 3 The result of different temperature to ferment yellow serofluid

由图3可知，pH随发酵温度的升高呈先下降后上升趋势；产酸量随发酵温度的升高呈先上升后下降趋势。

当发酵温度为 27～37℃时，产酸量随发酵温度的升高而升高；37℃时，产酸量达到最大值 0.6077 g/100mL，比27℃组最小值0.3507g/100mL提高73.28%，表明37℃适宜黄浆水自然发酵产酸，产酸量显著高于其余各组（p<0.05）；当温度由 37℃升至 42℃时，产酸量显著降低，这是由于温度过高，抑制产酸菌的生长所致。结果表明，37℃是黄浆水自然发酵产酸的最佳培养温度。

2.1.4 不同发酵时间对黄浆水自然发酵的影响

图4 发酵时间对黄浆水自然发酵的影响Fig. 4 The result of different time to ferment yellow serofluid

由图4可知，当发酵时间由24h升至48h时，pH缓慢下降；当发酵时间为48h时，pH达到最低；当发酵时间为48～120 h，pH随发酵时间的延长而显著上升。

当发酵时间由24h延长至48h时，产酸量显著上升；发酵时间为48 h时，产酸量达最大值0.7254g/100mL是120h组最小值0.1026g/100mL的7.07倍，显著高于其余发酵时间组（p<0.05）；随后产酸量随发酵时间的延长而显著降低，这是因为发酵后期腐败菌导致产酸量下降所致，表明适宜发酵时间可以促进菌株发酵产酸。结果表明，黄浆水自然发酵时间以48h为宜。

2.1.5 不同接种量对黄浆水自然发酵的影响

图5 接种量对黄浆水自然发酵的影响Fig. 5 The result of different inoculum size to ferment yellow serofluid

由图5可知，接种量为3%～6%时，随接种量的增加，黄浆水pH降低；接种量为6%时，pH达到最低为3.61；接种量为6%～15%时，随接种量的增加pH升高；接种量为15%时，pH达到最高。

接种量由3%升至6%时，黄浆水产酸量缓慢升高；接种量为6%时，产酸量达到最高为0.5063g/100mL是最小值15%组0.2256g/100mL的2.24倍，表明黄浆水接种量为6%时适宜黄浆水发酵产酸，产酸量显著高于其余各组（p<0.05）；接种量6%～15%，随接种量的增加产酸量降低。结果表明，接种量以6%为宜。

2.2 均匀试验结果与分析

由单因素结果可知，黄浆水中添加面粉时产酸量最高，pH最低，表明添加面粉能较好的促进黄浆水发酵产酸，并且面粉是最常见的食品原料之一，故选择面粉为最佳天然促生因子。均匀设计U10（54）结果见表2。

表2 U10（54）均匀设计试验结果Table 2 U10（54）The results of uniform design experiments

试验结果经DPS软件数据处理系统进行二次多项式逐步回归分析，得回归方程：Y=1.9441-0.0441X1-9.8839X2-0.0076X3+2.6791X4+0.0005X12+46.9041X22+0.00004X32+5.6626X42

根据相关系数R=94.89%,剩余标准差S=0.0927，表明该模型与实际试验拟合程度很高，能很好的拟合黄浆水自然发酵条件。

经DPS软件二次多项式逐步回归，得出最高指标时各个因素组合为：X1=37.08，X2=0.03，X3=24.18，X4=0.075，即发酵温度为37.08℃，接种量为3%(v/v)，发酵时间为24.18h，面粉添加量为7.5%(w/v)，此时产酸量得率最高为0.8537g/100mL。为便于生产应用，调整黄浆水自然发酵条件为发酵温度37℃，接种量3%(v/v)，发酵时间 24h，面粉添加量 7.5%(w/v)。按照上述条件进行三次验证试验，得产酸量为0.8301g/100mL，达到回归预测理论值（0.8537g/100mL）的97.24%，表明最佳发酵条件可靠。

3 讨论与结论

3.1 由于制作豆腐时加工条件不同、使用凝固剂不同等原因，导致产生的黄浆水pH不尽相同。酸浆中主要是乳酸菌产酸，适宜乳酸菌生长的MRS培养基初始pH为6.2±0.2，故将黄浆水初始pH统一调整为6.2。

3.2 通过比较4种天然促生因子对黄浆水自然发酵产酸的研究，面粉为最佳天然促生因子。面粉添加量为4%时，其产酸量为0.6251g/100mL，是葡萄糖0.5742g/100mL的1.09倍，空白0.3042 g/100mL的2.05倍，表明添加面粉能较好的促进黄浆水发酵产酸。

3.3 将生物培养基中的常规碳源葡萄糖与天然促生因子碳源进行经济性比较，表明面粉是一种来源广泛，价廉物美，经济性良好，能有效促使黄浆水自然发酵的天然促生因子。

3.4 均匀试验优化黄浆水自然发酵产酸的最佳发酵条件为：发酵温度37 ℃，接种量3%(v/v)，发酵时间24h,面粉添加量7.5%(w/v)，培养基初始pH 6.2，产酸量达0.8301g/100mL；比单一黄浆水自然发酵产酸量0.3042 g/100mL提高2.73倍，明显提高了黄浆水自然发酵的产酸量。

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