张晓燕，古丽娜孜，库米拉，陈卫林，王小标，杨 静，王雪薇，韩艳鹏，武 运

(新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052)

生活在低温环境下的微生物称为低温微生物，主要分为嗜冷菌(psychrophiles)和耐冷菌(psychrotrophs)两类，前者是指在0℃可生长繁殖，最适温度不超过15℃，最高温度不超过20℃的细菌、真菌和藻类等微生物［1］;后者是指在0～5℃可生长繁殖，最适生长温度可达20℃以上的微生物。低温微生物能够在低温条件下产生一些具有较高催化效率的低温酶，来维持细胞新陈代谢的正常运行［2］。

目前，对低温蛋白酶的研究主要集中在从极地、冰川、雪山、深海等长年极冷环境选育产酶的冷适微生物、通过化学诱变和物理诱变筛选高产低温蛋白酶菌株［3］、冷适蛋白酶提纯及酶学特性研究［4］、从分子水平解析适冷机制并进行化学修饰保护酶的热稳定性［5］。低温蛋白酶具有低温易反应，高效活力，热损失少等优点，因此，在食品、环境修复、化妆用品、医药等领域有着中温蛋白酶无法比拟的优越性［6－7］。对于陆地常冷环境冻土、高海拔地区产冷适蛋白酶菌株鲜有报道。本文基于新疆冻土资源充裕，以新疆阿勒泰进山口植物根际冻土为材料，旨在应用微生物发酵法筛选产低温蛋白酶菌株，筛选出一株产冷适蛋白酶的菌株，16S rDNA鉴定为沙雷氏菌(Serratia sp.)，这为冷适蛋白酶的进一步提取纯化、研究酶学特性奠定基础，为开发新疆特色果蔬加工低温酶制剂提供理论与技术支持，为新疆丰富的果蔬加工工业提供方便、高效、快捷的非热加工方式，来保持果蔬及果蔬制品特有的风味，色泽，营养。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

土样采自新疆阿勒泰进山口，采集时间是2012年3月，采集时环境温度为0～10℃。将土样置于无菌铝盒中，做好标记，放置保温箱中当天运回，－20℃保存备用;ZP301细菌基因组 DNA提取试剂盒、DL2000 PlusDNAMarker、ZT2012 × TaqPCR MasterMix(含染料)、10mg/mL EB染色液 北京庄盟国际生物基因科技有限公司;primer1:(5'－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3')primer2:(5'－AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA－3')华大基因;革兰氏染色液［8］、1mol/L pH8.0 Tris－HCl、20mg/L 蛋白酶K 上海百祥生物科技有限公司;10mg/mL溶菌酶北京百泰克生物技术有限公司;50×TAE(Tris－乙酸)、1%溴酚蓝指示剂 北京索莱宝科技有限公司;0.5μg/mL EB 染色液［9］;液体富集培养基 葡萄糖1.00%，蛋白胨0.50%，酵母浸粉0.50%，MgSO4·7H2O 0.02%，K2HPO40.10%，NaCl 1.00%，Na2CO31.00%，pH 7.2;LB培养基 蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1.0%，(固体加2%的琼脂)，pH 7.2;选择培养基 酵母浸粉0.1%，NaCl 1.0%，酪蛋白2.0%，琼脂2.0%，pH 7.2。培养基均在 121℃灭菌 20min后，待用。

LD2X－30KA立式电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;HR40－ⅡA2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司;DHP－9162电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司;DZKW－D－2电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂;XSP－2CA生物显微镜 Motic实业集团有限公司;FA2104N分析天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;THZ－98A恒温振荡箱 上海一恒科学仪器有限公司;050－810Tgradient48 PCR扩增仪 德国Biometra公司;DYY－7B电泳仪 北京六一仪器厂;JY04S凝胶成像仪 北京君意东方电泳设备有限公司;MiniSpin离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株驯化 在容积100mL的三角瓶内装50mL生理盐水，放几颗玻璃珠，121℃灭菌20min，冷却后在无菌操作台上，将土样加到无菌生理盐水中，制成 1%土壤悬浮液，摇匀，待用。(注意:每隔20min震荡一次，震荡数次充分混匀后，在无菌操作台上，静置30min)

在500mL三角烧瓶内装50mL液体富集培养基，在121℃灭菌20min后冷却，在超净工作台上准确移取5mL上述1%的土壤悬浮液，加入到三角烧瓶中，在20℃ 200r/min培养1天，待用。

1.2.2 产低温蛋白酶菌株的初筛 在无菌操作台上，分别取驯化好的菌悬液0.5mL，加入到4.5mL无菌生理盐水中，用梯度稀释法得到不同稀释度的稀释液，即 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7。每个稀释度做两个平皿，分别移取0.1mL的菌液，移入凝固干燥后的固体初筛培养基平皿中，用涂布棒涂匀，在20℃的培养箱中恒温培养24～48h，观察有无透明圈出现，将初筛得到的产酶菌株，挑单个菌落，在选择培养基上点样，20℃培养24～48h后，加入10%的TCA终止反应，测量菌落直径以及透明圈直径。每个菌株做三个平皿，平行测量三次，取平均值。在菌落边缘可看到透明圈的菌株即为要筛选的菌株。

1.2.3 产低温蛋白酶菌株的复筛 蛋白酶活力的测定:按照国标GB/T23527－2009规定的福林酚显色法(Folin)测酶活进行菌株的复筛，蛋白酶活性定义:在pH7.0和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。同一个样品测三次，取平均值。

1.2.4 产低温蛋白酶菌株鉴定 用肉眼观察平板上单个菌落的颜色、大小、形状等特征，记录;再用革兰氏染色法观察菌株的显微镜形态，按照文献［10］对菌株进行初步鉴定。按照文献［11－12］进行菌株生理生化鉴定，通过李远［13］等的方法扩增菌株的16S rDNA，扩增成功的PCR产物，送至北京六合华大公司测序，获得的测序结果递交GenBank数据库中Blast，进行相似同源性分析，Maximum likelihood法绘制系统发育树，BOOTSTRAP分析法，选取重复1000评估树的准确性。

1.2.5 菌株生长曲线及产酶曲线的绘制 将菌株接入液体培养基中，在22℃的摇床中150r/min进行培养，通过连续测定(每隔2h)液体培养基中细菌的OD600nm吸光值及酶活力，确定菌株生长状况及产酶情况，绘制生长曲线和产酶曲线。

1.2.6 菌株A29－2生长特性的初步研究 将活化好的种子液以1%的接种量接入液体培养基中，通过连续测定液体 OD600nm吸光值，研究菌株在 4、18、20、22、25、28、30、37℃下的生长情况。测定菌株在初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 及质量分数 0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、4.00%、8.00%的 NaCl中22℃培养24h后的生长量。

2 结果与分析

2.1 产低温蛋白酶菌株的筛选

通过平板分离初筛及复筛方法，在20℃培养条件下恒温孵育48h后加入10%的TCA溶液终止反应，从植物根际土壤中筛选出9株产低温蛋白酶菌株，表1是水解透明圈d1与菌落直径d2测量结果。

从图中可以看出，菌株A29－2和A29－3透明圈与菌落直径之比d1/d2的值均大于3.00［14］，后续工作中测得菌株A29－2和A29－3的酶活力依次是31.88U/mL和7.04U/mL，说明透明圈的大小与酶活力的大小成正相关，故此方法可用于筛选产低温蛋白酶菌株［15］。菌株A29－2的酶活力较大，作为后续工作的研究对象。

表1 菌株筛选的结果Table 1 Results of strains screening

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌株形态学鉴定 菌株A29－2在酪蛋白分离培养基上形态特征如图1所示:单个菌落表面圆滑湿润，凸起，规则圆形，呈乳白色，边缘整齐，不透明。显微镜下的形态如图2所示为单细胞呈短杆状，不规则排列，革兰氏阴性，无芽孢，有荚膜。

图1 菌株A29－2的平板特征Fig.1 Plate characteristics of strain A29－2

图2 菌株A29－2的镜检特征Fig.2 Microscopic characteristics of strain A29－2

2.2.2 生理生化鉴定 研究结果见表2:菌株A29－2可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、L－阿拉伯糖、D－半乳糖、D－棉籽糖、D－木糖、甘露醇、甘露糖、密二糖、海藻糖产酸产气，不能分解乳糖、水杨苷产酸。M－R实验、H2S实验、吲哚实验为阴性;接触酶实验、V－P实验、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、柠檬酸盐实验为阳性;石蕊牛乳实验结果为牛奶结块凝固，不变色或蓝色，即酶凝。说明菌株A29－2具有产低温蛋白酶的能力。

2.2.3 菌株A29－2的16S rDNA鉴定 由图3可知，菌株A29－2 PCR扩增出的条带在1500bp左右，说明成功的扩增出菌株A29－2的16S rDNA片段;将菌株A29－2的测序结果，通过NCBI进行16S rDNA数据库BLAST，选取序列相似度达99%的部分菌种，采用软件DNAman和 Mega5.05，Maximum likelihood法制作系统发育树，结果见图4，菌株 A29－2与标准菌株NR_042356.1在同一支系，相似率达到99%，故菌株A29－2鉴定为沙雷氏菌(Serratia ureilytica strain_NiVa 51)。

表2 菌株A29－2生理生化鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain A29－2

图3 菌株A29－2 PCR电泳胶图Fig.3 PCR electrophoresis gel figure of strain A29－2

2.3 菌株生长特性的初步研究

图4 菌株A29－2的系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of strain A29－2

2.3.1 菌株A29－2的生长和产酶曲线 通过连续测定液体培养基中菌株A29－2的OD600nm吸光值，由图5可知，菌株A29－2在22℃环境中能较快生长，4～18h为对数生长期，培养18h后基本达到稳定期;在最初的8h内酶活力几乎没有;20h后才渐渐开始产酶，此时菌株处于稳定期;随着菌株逐渐衰亡，产酶能力也越来越强，说明酶的产生发生在菌株生长的中后期。

图5 菌株A29－2的生长和产酶曲线Fig.5 The growth curve and enzyme production curve of strain A29－2

2.3.2 温度对菌株A29－2生长的影响 温度对菌株A29－2生长的影响如图6所示，菌株A29－2在4～30℃均能生长，且最适生长温度为22℃，37℃不生长，表明该菌是低温菌。在不同温度下，培养18h后均陆续进入稳定期，且18h的生长量最大;随着温度的升高，菌株到达生长高峰的时间提前，加速了菌株的死亡。

图6 温度对菌株A29－2生长的影响Fig.6 The effect of temperature on the growth of strain A29－2

2.3.3 初始pH对菌株A29－2生长的影响 初始pH对菌株A29－2生长的影响如图7所示，菌株A29－2在初始pH为6.0～8.0生长较快，最适初始pH为7.0。

图7 初始pH对菌株A29－2生长的影响Fig.7 The effect of initial pH on the growth of strain A29－2

2.3.4 NaCl质量分数对菌株A29－2生长的影响NaCl质量分数对菌株A29－2生长的影响如图8所示，NaCl质量分数为0.00%～1.00%时，菌株A29－2生长最快，且最适NaCl质量分数为1.00%。

图8 NaCl质量分数对菌株A29－2生长的影响Fig.8 The effect of mass fraction of NaCl on the growth of strain A29－2

3 结论

本研究通过微生物发酵法分离筛选出9株产低温蛋白酶菌株，其中菌株A29－2所产低温蛋白酶活性最高，为31.88U/mL。通过微生物学鉴定方法对菌株A29－2进行形态学、生理生化及16S rDNA鉴定，经序列同源性分析，鉴定该菌属于沙雷氏菌(Serratia sp.)，该研究与迟乃玉等［15］、刘静等［16］、全桂静等［17］学者分离筛选所得的菌种有所不同，本研究得到一株新菌种，并对新菌种的生长特性进行初步探讨，菌株A29－2生长最适温度为22℃，且在4℃可以生长，37℃不生长。根据耐冷菌能够在0～5℃左右生长，最适生长温度约20℃左右的特性，可以确定该菌为耐冷菌。且最适初始pH为7.0，在pH10.0时生长最缓慢，pH4.0时生长较缓慢，因此，该菌耐碱性差，但具有一定的耐酸性。该菌最适NaCl质量分数为1.00%，超过1.00%时，菌株生长加速死亡，所以，该菌具有一定的耐盐性。本研究筛选的菌株A29－2为进一步提取纯化低温蛋白酶和研究酶学特性奠定了基础。

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