杨 双 郑喜群 刘晓兰 周利敏 马艳秋

YANG Shuang 1，2 ZHENG Xi－qun 1，2 LIU Xiao－lan 1，2 ZHOU Li－min 1，2 MA Yan－qiu 1，2

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar，Heilongjing 161006，China；2.Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang，Province Normal University，Qiqihar，Heilongjing 161006，China）

玉米蛋白粉酶解获得的酶解物，经物理处理后，可制备出具有多种生理功能的玉米肽，具有促进乙醇代谢［1］，消除运动后的疲劳［2］，降低血糖［3］和降血压［4］等功能。玉米肽主要是分子量＜1 000 Da的短肽，可以被肠道内直接吸收，而且吸收速度要比游离氨基酸和蛋白质快2～3倍，从而更能发挥其生物功能［1］。

玉米肽的许多生理功能与其抗氧化活性有关，抗氧化活性主要是用于评价样品清除自由基的能力。要想了解玉米肽的综合抗氧化能力就要通过检测玉米肽对O·、·OH、DPPH等自由基的清除能力，及其与Fe2＋的螯合能力和将Fe3＋还原成Fe2＋的能力。

复合蛋白酶（protamex）通常用作多种酶分步水解谷物蛋白的研究［5］，或者用于研究单酶水解谷物蛋白条件的优化［6］，以追求更大的水解度和可溶性蛋白含量，然而Protamex单独水解谷物蛋白的可溶性蛋白含量较碱性蛋白酶或多酶复合水解效果低4倍以上，所以极少有学者研究Protamex单酶作用玉米蛋白的功能性质［5］，也未曾有报道表明前人有对Protamex酶解物做过如此全面的抗氧化活性研究。玉米蛋白的功能性质之一——抗氧化活性与其分子量分布密切相关［7］，所以本研究拟通过改变水解时间来控制Protamex水解玉米蛋白粉的水解度，制备出不同分子量分布的玉米肽［7］，并研究其抗氧化活性变化，探究水解时间对玉米肽抗氧化活性的影响，进而对Protamex酶解物的抗氧化活性的机制研究提供依据，也为提高这类原料的附加值，改善其功能特性，为开创良好的经济和社会效益服务。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

玉米蛋白粉：黑龙江龙凤玉米开发有限公司；

α－淀粉酶：酶活30 U／g，北京奥博星生物技术责任有限公司；

复合蛋白酶：食品级，酶活13.59万U／g，由枯草杆菌发酵产生，诺维信公司；

三羟甲基氨基甲烷（Tris）：色谱纯，上海生工生物股份有限公司；

其余药品：均为实验室常规分析纯。

1.2 试验仪器和设备

双螺杆挤压膨化机：DS32－Ⅱ型，上海跃进医疗器械厂；

722型紫外分光光度计：TU－1901型，上海精密科学仪器有限责任公司；

高速离心机：CF15RX型，北京医用离心机厂；

集热式磁力加热搅拌器：DF－Ⅰ型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 样品的制备和提取

1.3.1 玉米蛋白粉的预处理

玉米蛋白粉→过80目筛→挤压膨化→去淀粉→去色素→预处理后蛋白粉

对玉米蛋白粉进行预处理主要是利用挤压膨化的高温、高压和高剪切力的作用，使其结构发生变化，如其中蛋白质的三、四级结构的结合力变弱，分子间氢键、二硫键等部分断裂，使物料形成结构相对疏松、多孔的膨化物料；另外，玉米蛋白粉中含有8%～10%的淀粉，与玉米蛋白紧密连接，形成层层包裹很难剥离开的复合体，也影响了玉米黄粉中蛋白的酶水解速度。所以酶解反应前采用一定的预处理方法使蛋白适当变性，破坏蛋白的高级结构，使玉米蛋白在分子内部的某些基团暴露在蛋白质分子的表面上，从而改善玉米蛋白粉的水溶性，增加蛋白酶对玉米蛋白的作用位点；有利于酶对玉米蛋白的水解。玉米蛋白粉预处理具体方法参照文献［6］。

1.3.2 样品酶解 底物浓度5%（m／V）（用微量凯氏定氮法测定预处理后的玉米蛋白粉蛋白含量是81.57%），调节料液的p H至7.0，温度为60℃时，再加入0.81% （m／V）的Protamex（酶 活 13.59 万 U／g），分 别 酶 解 15，30，60，90，120 min。酶解过程用2 M NaOH滴定保持p H恒定，记录消耗NaOH的体积。酶解完成后于90℃水中灭酶10 min，4 000 r／min离心15 min，上清液再经定性滤纸（中速，型号102）过滤，即获得玉米肽液，冷冻抽干制成玉米肽粉后于干燥器中保存［6］。不同水解时间制得样品分别标记为P－15，P－30，P－60，P－90，P－120。1.4 水解相关指标测定

（1）酶活测定：按SB／T 10317—1999执行；

（2）水解度：p H－stat法［8］；

（3）可溶性蛋白含量：福林酚法［8］。

1.5 玉米肽的分子量分布

采用体积排阻色谱法，运用高分离度凝胶色谱预装柱Superdex Peptide 10／300 GL（10×300～310 mm），及 Purifier100蛋白纯化仪测定。流动相为 p H 7.0（20 mmol／L）含0.15 M NaCl 的 磷 酸—磷 酸 盐 （PBS）缓 冲 液，流速0.25 m L／min，在波长214 nm下检测。配制玉米肽浓度为2 mg／m L（标准曲线的标样浓度为2 mg／m L），进样前过0.22μm的微孔过滤膜，进样量100μL。

1.6 抗氧化活性测定

玉米肽抗氧化的各指标测定中所用的样品浓度均为10 mg／m L，充分溶解后4 000 r／min离心15 min，取上清液进行测试，并用0.05%的Vc作对照。每个样品的每个指标平行测定3次，结果取平均值。

1.6.1 清除DPPH自由基的测定 根据Shimada等的方法［9］，修改如下：取2 m L 0.1 m M DPPH 无水乙醇溶液加入2 m L样液里，混合均匀，避光反应30 min，在517 nm处测其吸光值为Ai；另取2 m L待测样品于试管中，分别加入无水乙醇2 m L，避光反应20 min，在517 nm处测吸光值；以2 L 0.1 m M DPPH无水乙醇溶液和2 m L无水乙醇反应作为参比，测吸光值。其清除率计算：

式中：

K——对DPPH自由基的清除率，%；

A0——2 m L 0.1 m M 的 DPPH 无水乙醇溶液加2 m L无水乙醇的吸光值；

Ai——2 m L 0.1 m M 的 DPPH 无水乙醇溶液加2 m L待测样品的吸光值；

Aj——2 m L无水乙醇加2 m L待测样品的吸光值。

1.6.2 清除·OH的测定 采用邻二氮菲—Fe2＋氧化法［10］。

（1）依 次 加 入 0.15 mmol／L PBS 1 m L、去 离 子 水0.5 m L摇匀；加入0.75 mmol／L FeSO40.5 m L，充分混匀；加入0.01%H2O20.5 m L，振荡1 min；加入0.75 mmol／L邻二氮菲无水乙醇溶液0.5 m L，37℃水浴60 min；在536 nm处检测反应体系的吸光度值；

（2）以0.5 m L去离子水替代1.6.2（1）中的0.5 m L H2O2，其余条件同1.6.2（1），测其吸光度值；

（3）分别以不同玉米肽溶液（或 Vc）0.5 m L替代1.6.2（1）中的去离子水，测其吸光度值。清除率计算：

式中：

D——对·OH自由基的清除率，%；

AS——待测 样 品 代 替 1.6.2（1）中 去 离 子 水 后在536 nm处的吸光值；

AP——反应体系在536 nm处的吸光值；

AB——用去离子水代替 H2O2参与1.6.2（1）反应时，其在536 nm处的吸光值；

式中：

I——抑制率，%；

V0——对照组邻苯三酚自氧化速率，A／min；

VS——样品组邻苯三酚自氧化速率，A／min。

1.6.4 与铁离子螯合能力的测定 根据 Kong等［12］的方法，修改如下：取0.5 m L的样品溶液，加入1 m L 20μM FeCl2，混匀后加入0.5 m M 菲洛嗪（ferrozine）溶液1 m L，剧烈震荡摇匀，室温下静置10 min，在563 nm处测定吸光值，以等体积去离子水取代样品溶液作为对照所测吸光值。

式中：

R——螯合率，%；

A0——对照组参与以上反应后在563 nm处的吸光值；

AS——样品组参与以上反应后在563 nm处的吸光值。

1.6.5 还原力测定 参照 Oyaizu等［13］的方法。

1.7 数据处理与分析

以上各项测定均做3次重复，用Excel软件对试验所得数据进行处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 水解时间对水解度及可溶性蛋白含量的影响

表1 Protamex水解时间对玉米蛋白粉水解度及可溶性蛋白含量的影响Table 1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis of CGM and the content of soluble protein by protamex

由表1可知，Protamex在前15 min时作用效果较快，随着水解时间的增加，水解度值和可溶性蛋白含量也随之增大，但是15 min到120 min之间的水解度增长幅度很小，而可溶性蛋白含量最高增长了166.4%。由此看来，Protamex水解预处理后玉米蛋白粉的水解度和可溶性蛋白含量与水解时间呈正相关。水解度和可溶性蛋白含量在水解时间达到60 min后增长幅度缓慢，水解体系在进行到一定程度后会达到水解平衡，即使继续延长水解时间其水解度和可溶性蛋白含量均可能不再增加，所以水解时间最大选在120 min，再延长水解时间意义不大。

2.2 水解时间对玉米肽的相对分子质量分布的影响

由表2可知，Protamex作用预处理后玉米蛋白粉15～120 min，分子量分布范围较大，其中10～17 k Da的大分子蛋白含量呈减少趋势；1 900～2 300 Da范围内的蛋白含量与水解时间成负相关；Protamex作用玉米蛋白粉制得的主要组分是450～700 Da之间的短肽，并且短肽的含量与水解时间总体呈现正相关。可见，水解时间可以有效影响Protamex对预处理后玉米蛋白粉的作用，15～120 min期间可逐渐将1 900～10 000 Da的大分子肽转化成＜700 Da的短肽，Protamex单独作用玉米蛋白粉120 min所得＜700 Da的短肽含量可达88.74%。并且有研究表明，肽的抗氧化活性与相对分子质量大小有关［7］，活性较强抗氧化肽的氨基酸残基数目一般在20个以内［14］。玉米肽的抗氧化能力与分子量密切相关，而分子量过大或过小其抗氧化能力均不能达到最好，但当玉米肽中的短肽含量适中，且含有某些能与自由基反应的特殊基团，即供氢基团，而只有当玉米肽分子量适中时这些特殊的供氢基团才能最大限度的被暴露出来并与自由基反应，体现更大的抗氧化活性［15，16］。

表2 水解时间对玉米肽分子量分布的影响Table 2 Effect of hydrolysis time on molecular weight distribution of corn peptide ／%

2.3 水解时间对玉米肽抗氧化活性的影响

图1 水解时间对玉米肽抗氧化活性的影响Figure 1 Effect of hydrolysis time on antioxidant activity of corn peptide

2.3.2 对酶解物清除·OH能力的影响 由图1可知，玉米肽清除·OH的能力与Protamex水解玉米蛋白粉的水解时间成正相关，并且在水解30 min时清除能力显著加强，当水解 到 120 min 时 达 最 大 值 为 （19.82±0.90）%，是0.05%Vc清除能力的72.13%。虽然用此方法玉米肽对·OH的清除率值并不高，但是与Vc比较，玉米肽对·OH的作用还是比较强的，而·OH是已知的氧自由基中最强的氧化剂，它可以起动脂质过氧化反应，几乎可以和所有细胞成分反应，对机体的危害极大。试验表明，短肽占比多时对清除·OH有更好的效果，水解时间的延长可以促进更多与·OH结合的基团裸露出来。

2.3.3 对酶解物清除DPPH能力的影响 由图1可知，玉米肽在清除DPPH的能力与Protamex水解玉米蛋白粉的水解时间无显著相关性，不同水解时间样品对DPPH自由基的清除均有较好的效果，水解15，30，60 min所制玉米肽都达到61%左右，且无显著差异，在水解到90 min和120 min时有所增加，清除率达到67%左右，达到0.05%Vc清除率的70.1%。而DPPH是人工合成的大分子自由基，它的化学稳定性来自共振稳定作用及3个苯环的空间障碍，从而使夹在其中间氮原子上的未成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。DPPH因具有单电子而使其在517 nm处有一强吸收（呈深紫色），当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可广泛用于自由基清除剂和抗氧化剂的筛选分析［18］。较高的清除DPPH自由基的能力说明本试验中的样品具有较强的提供质子的能力，质子与自由基结合后就可以阻止自由基对机体细胞的氧化损伤。

2.3.4 对酶解物与Fe2＋的螯合能力的影响 由图1可知，玉米肽显示出了很强的与Fe2＋的螯合能力，在水解15 min时螯合率即可达到（82.08±0.43）%，但也体现出其螯合率与水解时间成反比关系，在水解到120 min时降至（74.44±1.95）%，而0.05%的 Vc却没有与Fe2＋螯合的能力。在这一点大大优于碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉制取的玉米肽，Kong等［12］研究表明碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉制取的玉米肽几乎没有与Fe2＋螯合的能力。这种较强的与Fe2＋螯合的能力可以使玉米肽抑制Fenton反应和Harber－Weiss反应，即：

从而减少·OH的产生，直接或间接减少了很多自由基的连锁氧化反应，Protamex水解物独具的与Fe2＋螯合的能力对其后续的功能性产品研发具有重要意义。

2.3.5 对酶解物还原能力的影响 由图2可知，玉米肽的还原能力与水解时间有正相关趋势，从水解15 min的0.145±0.001增加到120 min的0.217±0.002，而0.05%的Vc还原能力达到了0.788±0.007。玉米肽的还原能力远远低于0.05%Vc的效果。虽然Protamex酶解物的还原力相对不高，但是其仍然具备一定的提供电子的能力，对金属离子引起的氧化起到一定的预防作用。

图2 水解时间对玉米肽还原力的影响Figure 2 Effect of hydrolysis time on reduce power of corn peptide

3 结论

研究结果表明，Protamex的水解作用可有效改善玉米蛋白粉的溶解性，水解度和可溶性蛋白含量与水解时间均呈正相关；Protamex作用玉米蛋白粉的水解时间决定了酶解物的分子量分布，而酶解物的分子量分布不同体现了不同的抗氧化活性，然而并不是短肽的含量高就对各种自由基有较好的清除能力，分子量＜700 Da的玉米短肽含量占60%以上对清除DPPH自由基和与Fe2＋的螯合能力较强，而对清除O·能力和还原能力较弱，但是P－120的综合抗氧化能力可与0.05%的Vc标准品相媲美。

自由基是机体正常代谢的产物，对于机体的正常代谢有一定的促进作用，但是机体内的自由基只能逐渐增多而不会缺失，过多的自由基会引起机体衰老、细胞损伤、死亡和组织伤害、细胞癌变等，所以适当的补充外源抗氧化剂对机体有特殊的意义。采用Protamex水解玉米蛋白粉2 h即可获得高效、较综合的抗氧化活性剂，这为玉米蛋白粉拥有更多良好的应用前景奠定了基础。

1 Yamaguchi M，Takada M，Nozaki O，et al.Preparation of corn peptide from corn gluten meal and its administration effect on alcohol metabolism in stroke－prone spontaneously hypertensive rats［J］.J.Nutr.Sci.Vitaminol，1996，42（3）：219～231.

2 李晶.玉米肽抗疲劳作用的实验研究［J］.食品与机械，2004，20（1）：11～12，27.

3 Mochida T，Hira T，Hara H.The corn protein，zein hydrolysate，administered into the ileum attenuates hyperglycemia via its dual action on glucagon－like peptide－1 secretion and dipeptidyl peptidase－IV activity in rats［J］.Endocrinology，2010，151（7）：3 095～3 104.

4 王俊彤，郑喜群，刘晓兰.酶解玉米黄粉制备降血压肽的研究［J］.食品与机械，2013，29（3）：212～215.

5 王晓杰，郑喜群，刘晓兰.双酶复合水解对玉米肽抗氧化活性的影响［J］.食品与发酵工业，2010（8）：102～105.

6 郑喜群.玉米黄粉的酶解工艺与抗氧化活性肽的制备［D］.北京：中国农业大学，2006.

7 李向红，陈志军，刘永乐，等.鲢鱼酶解产物分子质量组成与抗氧化性［J］.食品科学，2013，34（17）：28～32.

8 王晓杰，郑喜群，胡立玉.双酶分步水解时问对玉米肽功能性质的影响［J］.食品工业科技，2013，34（8）：223～227.

9 Shimada K，Fujikawa K，Yahara K，et al.Antioxidative properties of xanthan on the antoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion［J］.J.Agric.Food Chem.，1992，40（6）：945～948.

10 金鸣，蔡亚欣，李金荣，等.邻二氮菲—Fe2＋氧化法检测H2O2／Fe2＋产生的羟自由基［J］.生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553～555.

11 贾之慎，杨贤强.茶多酚（TP）清除活性氧自由基 O2－·和·OH的分光光度法研究［J］.中国茶叶，1993，19（1）：25～27.

12 Kong B H，Xiong Y L.Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action［J］.J.Agric.Food Chem.，2006，54（16）：6 059～6 068.

13 Barros L，Baptista P，Correia D M，et al.Effects of conservation treatment and cooking on the chemical composition and antioxidant activity of Portuguese wild edible mushrooms［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55 （12）：4 781～4 788.

14 罗文峰，吴新亮，郭勇.乌骨鸡多肽的体外抗氧化活性研究［J］.食品科技，2009，34（10）：200～204.

15 Tang X Y，He Z Y，Dai Y F，et al.Peptide fractionation and free radical scavenging activity of zein hydrolysate［J］.J.Agric.Food Chem.，2010，58（1）：587～593.

16 张晓峰，陈庆森，庞广昌.玉米短肽的制备及其抗氧化活性的研究［J］.食品科学，2005，26（9）：33～35.

17 Halliwell B，Gutteridge J M.Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease：an overview［J］.Methods Enzymol，1989（186）：1～85.

18 Joshi G，Sultana R，Perluigi M，et al.In vivo protection of synaptosomes from oxidative stress mediated by Fe2＋／H2O2or 2，2－azobis－（2－amidinopropane）dihydrochloride by the glutathione mimetic tricyclodecan－9－yl－xanthogenate［J］.Free Radie.Biol.Med.，2005，38（8）：1 023～1 031.