翟清燕 赵龙玉 赵凤春 杨正友

ZH AI Qing－yan ZH AO Long－yu ZHAO Feng－chunYANG Zheng－you

（山东农业大学生命科学学院农业微生物重点实验室，山东 泰安 271018）

（Key Laboratory for Agriculture Microbiology，College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian，Shandong 271018，China）

近年来，随着人们对于饮食的追求趋向营养化和多样化，对豆类功能的研究也在不断深入，豆类加工企业的竞争焦点渐渐由普通豆制品的生产向功能性豆制品的开发与研制转移［1］。尤其是乳酸菌发酵豆制品以其特有的保健作用受到消费者的青睐，是一种既体现了乳酸菌益生特性又包含了大豆营养成分的新型营养健康食品［2］。

豆乳经发酵后既能发挥大豆的营养及功能特性，又能利用益生菌的益生作用产生抗菌肽、胞外多糖等大豆中原来没有的营养物质，其含有的β－葡萄糖苷酶还可以水解大豆异黄酮的糖苷结构向生物活性更高的游离型结构转化，大大提高了大豆制品的营养价值［3］。但大豆中同时含有多种抗营养因子，包括大豆脂肪氧化酶、胰蛋白酶抑制剂［4］、植酸等，这些抗营养因子对其食用价值会产生不利影响，且大豆具有的豆腥味阻碍了其制品的进一步发展。

近年来，植物乳杆菌作为新型益生菌其潜在的益生作用被不断挖掘，广泛应用于食品发酵生产中。已有研究［5］发现植物乳杆菌不仅可以定植于肠道中加速肠道蠕动，促进营养物质的快速吸收，其产生的醇、酸等挥发性风味物质能够改变豆乳的风味，赋予发酵豆乳特有的香味，同时，还可利用大豆中存在的棉籽糖等低聚糖进行发酵产酸，避免其被肠道微生物分解代谢产生CO2、H2等气体，从而引发胃痛、胃胀、排气、腹泻等症状［6］，为功能性发酵豆乳的进一步研发生产提供一定的技术基础。本研究拟利用本实验室分离筛选自传统发酵食品中的一株益生乳酸菌Lactobacillus plantarum 4发酵豆乳，对其在发酵和贮藏期间的发酵特性及贮藏稳定性进行评价，同时探索不同处理方法对大豆抗营养因子的影响，为研制出一种风味和营养兼具的功能性发酵豆乳提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

大豆：市售；

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum 4）：本实验室保藏菌株；

MRS培养基、邻苯二甲醛（OPA）、β－巯基乙醇：日本Sigma公司；

其他试剂：均为分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电热恒温培养箱：DHP－9162型，上海一恒科技有限公司；

数显恒温水浴锅：HH－2型，国华电器有限公司；

p H计：PHS－3C型，上海精科有限公司；

多功能榨汁机：SQ2119型，上海帅佳电子科技有限公司；

高速冷冻离心机：5804R型，德国Eppendorf公司；

紫外可见分光光度计：UV－2100型，美国Amersham Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 发酵豆乳生产工艺流程

挑选大豆（无霉烂、变质）→清洗浸泡→磨浆→过滤→分装→灭菌（95℃，15 min）→冷却备用→接种→37℃培养→后熟→成品［7］

1.2.2 Lactobacillus plantarum 4在豆乳中发酵特性的研究 将活化好的Lactobacillus plantarum 4菌种按约为1.8×106CFU／m L的接种量接种于已灭菌的豆乳中，置于37℃恒温培养［8］，以p H 值降到4.5为发酵终点，每隔1 h取样测定其p H值、滴定酸度、蛋白水解能力、活菌数、脱水收缩性等指标，并对发酵终产品进行感官品评。

1.2.3 发酵产品贮藏稳定性的研究 将制备好的发酵豆乳分别置于低温（4℃）和室温（25℃）下贮藏21 d，每隔3 d取1瓶发酵样品，测定其p H值、滴定酸度、活菌数和脱水收缩性，作为评价其贮藏稳定性的指标。

1.2.4 大豆抗营养因子的去除 大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂是大豆中两种主要的抗营养因子，对其食用价值产生不利影响，分别运用了热磨法、去皮法、Na HCO3溶液和柠檬酸盐溶液浸泡等方法来处理大豆，测定不同处理方法对发酵豆乳样品中大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂活性的影响。

（1）热磨法：将大豆浸泡12 h后，用80～100℃的热水磨浆；

（2）去皮法：将大豆浸泡12 h后，去皮，常温磨浆；

（3）Na HCO3溶液浸泡：将大豆用0.25%Na HCO3溶液浸泡12 h，沥干，常温磨浆；

（4）柠檬酸盐溶液浸泡：将大豆用0.2%柠檬酸盐（柠檬酸∶柠檬酸钠＝1∶1）溶液浸泡12 h，沥干，常温磨浆。

1.2.5 测定方法

（1）p H值的测定：采用精密p H计测定。

（2）滴定酸度（吉尔涅尔度°T）的测定：按GB 5413.34—2010中的方法进行测定［9］。

（3）活菌数测定：采用 MRS琼脂培养基平板倾注法［10］，37℃培养48 h后计算菌落总数。

（4）蛋白水解能力的测定：采用邻苯二甲醛（OPA）衍生比色法［11］，以未发酵处理的豆乳作为空白对照，测定在340 nm下的吸光值来表示发酵豆乳的蛋白水解程度。

（5）脱水收缩性的测定：称取15.0 g发酵豆乳样品进行过滤，21℃放置90 min，收集滤液并称重。按式（1）计算脱水收缩性：

（6）感官评价：由10名学生志愿者组成感官品评小组，并接受感官分析培训，分别从样品的表观、气味、风味和质地4个方面进行评价（见表1）［12］。

（7）大豆脂肪氧化酶活性的测定：参考文献［13］。

（8）大豆胰蛋白酶抑制剂活性的测定：参考文献［14］。

表1 发酵豆乳感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented soymilk

1.2.6 数据处理与分析 发酵豆乳各指标均平行测定3次，使用SPSS 17.0软件进行方差分析，Origin 7.5软件进行数据作图。

2 结果与分析

2.1 Lactobacillus plantarum 4在豆乳中的发酵特性研究

2.1.1 发酵豆乳样品在发酵期间酸度的变化 由图1可知，发酵豆乳样品达到终点（p H 4.5）用时为8 h。发酵过程中，p H值一直呈下降趋势，滴定酸度呈上升趋势（P＜0.05）。发酵初期，p H变化较为缓慢，2 h后下降趋势明显变快，发酵结束时p H降到4.48；而滴定酸度从开始到发酵结束一直呈上升趋势，这可能是由于发酵期间菌体生长代谢产生大量的乳酸，从而导致p H值的快速下降和滴定酸度的迅速上升。

图1 L.plantarum 4发酵豆乳酸度变化Figure 1 Changes ofacidity of fermented soymilk with L.plantarum 4

2.1.2 发酵豆乳样品在发酵期间活菌数的变化 由图2可知，发酵过程中，发酵豆乳样品中的活菌数持续升高（P＜0.05），在生长初期活菌数含量变化较缓慢，到了对数生长期间，活菌数迅速增加，6 h后趋于平缓。按照酸奶国家标准的要求，市售酸奶产品中必须有活菌且数量不能低于106CFU／m L，本研究利用L.plantarum 4发酵豆乳其活菌数可达到108CFU／m L以上，表明该菌株具有良好的增殖性与稳定性。

图2 L.plantarum 4发酵豆乳活菌数变化Figure 2 Changes of viable counts of fermented soymilk with L.plantarum 4

2.1.3 发酵豆乳样品在发酵期间蛋白水解能力的变化 由图3可知，发酵期间在340 nm处测定的吸光度值一直呈上升趋势（P＜0.05），表明对蛋白质的水解能力越来越大，有益于益生菌在豆乳中更好的生长。发酵初期，菌体生长代谢缓慢，对蛋白的水解能力较弱，随着发酵时间的延长，菌体能够充分水解利用豆乳中的蛋白，进而游离氨基酸含量迅速增加，吸光值随之迅速升高。研究结果表明，蛋白水解能力高的益生菌能够更好的在豆乳中生长且具有较高的存活率。

图3 L.plantarum 4发酵豆乳游离氨基酸含量变化Figure 3 Changes offree amino acid content of fermented soymilk with L.plantarum 4

2.1.4 发酵豆乳样品在发酵期间脱水收缩性的变化 由图4可知，发酵期间，发酵豆乳的脱水收缩性整体呈下降趋势（P＜0.05），0～3 h时豆乳呈液态，持水力较差，随着发酵时间的延长，菌体进入对数生长期，益生菌产酸使蛋白质变性凝集，脱水收缩性显著降低。低的脱水收缩性有助于发酵豆乳的贮藏和保形能力，Roland J.Siezen等［15］研究发现植物乳杆菌在生长过程中产生的胞外多糖可以提高酸奶产品的拉丝性和黏度，并降低其脱水收缩性，所以其产品中可以不用添加稳定剂。

图4 L.plantarum 4发酵豆乳脱水收缩性变化Figure 4 Changes ofsyneresis of fermented soymilk with L.plantarum 4

2.2 Lactobacillus plantarum 4发酵豆乳贮藏稳定性的研究

2.2.1 贮藏期间发酵豆乳酸度的变化 由表2可知，L.plantarum 4发酵豆乳样品随着贮藏时间的延长，p H与滴定酸度相对应，p H值越低，滴定酸度越高。低温（4℃）贮藏期间p H和酸度值基本保持稳定，变化幅度很小，表明L.plantarum4有较强的耐酸性，这也是储藏期间发酵豆乳中能保持活菌数较高的原因之一。而在室温（25℃）贮藏时，p H值和滴定酸度值变化幅度十分明显，可能是由于在室温条件下菌体仍能利用豆乳中的营养物质进行繁殖产酸，不利于酸奶的贮藏和品质控制。

表2 贮藏期间发酵豆乳酸度变化Table 2 Changes of acidity during storage time of fermented soymilk

2.2.2 贮藏期间发酵豆乳活菌数的变化 由图5可知，将发酵豆乳样品分别置于低温（4℃）和室温（25℃）条件下贮藏21 d，样品中的活菌数均有不同程度的降低。在贮藏初期，两种样品中活菌数变化均不显著，随着贮藏天数的增加，菌体进入衰退期，活菌数明显减少（P＜0.05）。而在相同贮藏时间内，常温贮藏条件下发酵豆乳中的活菌数明显低于低温贮藏，常温贮藏21 d后样品中的活菌数仅为3.38×105CFU／m L，说明发酵豆乳不适合在室温下长时间存放，而在低温条件下菌体生长代谢缓慢，具有良好的贮藏稳定性，有利于产品的保存。

2.2.3 贮藏期间发酵豆乳脱水收缩性的变化 由图6可知，低温贮藏条件下，样品的脱水收缩性上升幅度不明显，其变化范围为26.51%～30.58%，有少量乳清析出，说明低温贮藏能够更好地保持产品的持水性，使其品质状态不受破坏。V.Ferragut等［16］对高压均质豆奶的理化性质进行研究，发现低温贮藏28 d后豆奶的脱水收缩性变化不显著，本试验所得结论与此相符。而在室温条件下贮藏21 d，产品的脱水收缩性大幅上升（P＜0.05），有大量乳清析出，这可能是由于菌体在豆乳中继续繁殖产酸，破坏了原有的酸凝胶体系，导致组成发酵豆乳三维凝胶网络的颗粒过度重排造成的［17］。

2.3 大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂活性抑制

通常抑制大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂活性的处理方法有：热磨法、去皮法、Na HCO3溶液和柠檬酸盐溶液浸泡法，本研究分别运用这4种方法来处理大豆，测定不同处理方法对样品大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂活性的影响，结果见表3。

图5 贮藏期间发酵豆乳活菌数变化Figure 5 Changes of viable counts during storage time of fermented soymilk

图6 贮藏期间发酵豆乳脱水收缩性变化Figure 6 Changes of syneresis during storage time of fermented soymilk

由表3可知，不同处理方法对大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂的影响效果不同，热磨法对两种酶的抑制效果最为显著（P＜0.05），经过热磨处理后测得的大豆脂肪氧化酶活性是原来的26.43%，胰蛋白酶抑制剂活性是未经处理的52.45%。去皮处理测得的脂肪氧化酶活性与未经处理的相比有所上升，可能是由于在去皮处理过程中增加了大豆与空气的接触，使其被氧化。Na HCO3溶液和柠檬酸盐溶液浸泡后测得的脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂的活性也均有不同程度的降低。因此，得出热磨法是抑制大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂的最佳方法，可以有效地去除大豆腥味，充分利用大豆的营养价值，而且该方法简单易行，适用于工业化生产的需要。

表3 处理方法对大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂活性的影响Table 1 Effect of different methods on the activity of soy lipoxygenase and trypsin inhibitor

表3 处理方法对大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂活性的影响Table 1 Effect of different methods on the activity of soy lipoxygenase and trypsin inhibitor

不同字母表示不同显著水平（P＜0.05）。

处理方法 脂肪氧化酶 胰蛋白酶抑制剂空白 4 640.00±122.20ab 27.15±0.63a热磨法 1 226.67±96.15d 14.24±0.81c去皮法 4 906.67±26.67a 26.20±0.25a Na HCO3 溶液浸泡 3 866.67±53.33b 21.80±1.15b柠檬酸盐溶液浸泡 2 240.00±92.38c 24.86±0.33ab

2.4 发酵豆乳感官评定

以L.plantarum 4发酵豆乳，将发酵结束的样品放入冰箱4℃冷藏24 h，从表观、气味、风味、质地4个指标进行评价，L.plantarum 4发酵产品凝乳状态良好，无沉淀和分层，无臭味、蒸煮味和豆腥味，有悦人的豆香味，口感细腻平滑，酸甜可口，综合得分为88.46分（表4）。

表4 L.plantarum 4发酵豆乳感官指标评价结果Table 4 The result about sensory evaluation of the fermented soymilk with L.plantarum 4

3 结论

本研究利用L.plantarum 4进行单菌发酵，该菌株在豆乳中生长良好，发酵结束时活菌数可达到2.33×108CFU／m L，蛋白水解能力和持水力都显著增加，发酵产品口感细腻平滑，无乳清析出，酸甜可口，无臭味和其它不良风味，并且在低温贮藏条件下能够始终保持较佳的感官品质，同时得出热磨法是钝化大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂的最佳方法。本研究结果显示L.plantarum 4发酵豆乳能够大大提高豆乳的生物活性，具备明显的潜力和优势，为发酵豆制品进一步应用于实际生产提供了必要的理论依据和技术支持。

1 张丹，郑遂，姜瞻梅，等.大豆发酵食品的展望［J］.现代食品科技，2006，22（2）：278～281.

2 E RFarnworth，I.Mainville，M P Desjardins，et al.Growth of probiotic bacteria and bifidobacteria in a soy yogurt formulation［J］.International Journal of Food Microbiology，2007（116）：174～181.

3 Tsai J S，Lin Y S，Pan B S，et al.Antihypertensive peptides and γ－aminobutyric acid from prozyme 6 facilitated lactic acid bacteria fermentation of soymilk［J］.Process Biochemistry，2006，41（6）：1 282～1 288.

4 陈聪，朱佳琳，刘鑫，等.大豆制浆过程中胰蛋白酶抑制剂影响的研究进展［J］.食品与机械，2012，28（5）：255～258.

5 黄亮.功能性酸豆奶的研制［J］.食品与机械，2004（6）：49～51.

6 Trenna D B，Stanley E.Reduction of levels of volatile components associated with the beany flavor in soymilk by lactobacilli and streptococci［J］.Journal of Food Science，2005，70（3）：186～189.

7 王水泉.益生植物乳杆菌P8在豆乳及牛乳中发酵特性的研究［D］.内蒙古：内蒙古农业大学，2011.

8 陈合，张秋红，舒国伟，等.温度对嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌发酵羊奶的影响［J］.食品与机械，2013，29（1）：23～26.

9 中华人民共和国卫生部.GB 5413.34—2010乳和乳制品酸度的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

10 方改霞，单林娜，李慧，等.多菌种酸奶中活性乳酸菌的计数方法研究［J］.微生物学杂志，2009，29（3）：101～104.

11 药璐，闵伟红，姜铁民，等.益生菌对发酵酸乳蛋白的影响［J］.食品科学，2013，34（23）：194～199.

12 张爱霞，生庆海.食品感官评定的要素组成分析［J］.中国乳品工业，2006，34（12）：51～53.

13 管斌，隋晓峰，孔青.大豆脱腥及胰蛋白酶抑制因子去除方法的研究［J］.中国酿造，2010（2）：151～154.

14 华蕾.豆制品中胰蛋白抑制剂活性测定方法的研究［D］.吉林：吉林大学，2007.

15 Roland J Siezen，Christof Francke，Bernadet Renckens，et al.Complete resequencing and reannotation of the Lactobacillus plantarum WCFS1 genome［J］.Journal of Bacteruology，2012，194（1）：194～196.

16 VFerragut，N S Cruz，A Trujillo，et al.Physical characteristics during storage of soy yogurt made from ultra－high pressure homogenized soymilk［J］.Journal of Food Engineering，2009（92）：63～69.

17 郭壮，王记成，闫丽雅，等.益生菌Lactobacillus casei Zhang对酸奶风味、质地及感官特性的影响［J］.中国乳品工业，2009，37（1）：14～20.