洪珍珍 何欣 洪滔

信号传导与转录激活因子3及细胞周期蛋白D1在口腔鳞癌中的表达及意义

洪珍珍 何欣 洪滔

目的 探讨信号传导与转录激活因子3（stat3）及细胞周期蛋白D1（cyclinD1）在口腔鳞癌组织中的表达及其与临床预后的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）对35例口腔鳞癌患者的癌组织、相应正常组织中stat3、cyclinD1基因mRNA的表达进行检测，并结合临床资料进行分析。结果鳞癌组织中stat3及cyclinD1mRNA的表达水平均明显高于相应正常组织的表达，差异有统计学意义（P＜0．05或0．01）。鳞癌组织中stat3mRNA的表达与cyclinD1mRNA的表达无明显相关（P＞0．05）。stat3、cyclinD1 mRNA的表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移明显相关（P＜0．05），而与性别、年龄、发生部位、肿瘤大小和病理分级之间无明显相关（均P＞0．05）。结论检测stat3、cyclinD1mRNA的表达可能有助于口腔鳞癌淋巴结转移和肿瘤临床分期的预测；口腔鳞癌发生、发展中stat3基因在mRNA水平上对cyclinD1的调控作用不明显。

stat3 cyclinD1 口腔 鳞状细胞癌 信使RNA

信号传导与转录激活因子3（stat3）在各种肿瘤细胞和组织中激活，通过调控下游靶基因如细胞周期蛋白D1（cyclinD1）等的表达调节转录，进而影响细胞的增殖、分化和凋亡，参与肿瘤的发生与发展[1-2]。cyclinD1是细胞周期相关蛋白，是G1/S期过渡的重要调控因子，可影响细胞周期，导致细胞失控性生长[3]。stat3通过调节cyclinD1的转录导致细胞周期紊乱，进而使细胞发生癌变。本研究通过逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）对口腔鳞癌患者的癌组织及相应癌旁正常组织中stat3、cyclinD1基因mRNA的表达进行检测，旨在探讨stat3和cyclinD1在口腔鳞癌发生、发展中的作用和意义。

1 材料和方法

1.1 组织标本 选取2005-07—2012-12在我院就诊并手术治疗的口腔鳞癌患者35例，所有患者术前均未行放疗。其中男20例，女15例，年龄39～82（57±13.4）岁；高分化鳞癌25例（I级），中、低分化鳞癌10例（Ⅰ～Ⅱ级4例、Ⅱ级2例、Ⅱ～Ⅲ级2例、Ⅲ级2例）。所有手术标本均经病理确诊，且肿块手术切缘处未见癌组织浸润。取肿块边界外1cm处的正常黏膜上皮组织作为对照。

1.2 试剂和引物 RNA提取试剂盒（Trizol），逆转录试剂盒及TaqDNA聚合酶均购自上海晶美生物工程有限公司。Stat3、CyclinD1及磷酸丙糖脱氢酶（GAPDH）引物用primer3.0软件设计，由上海博亚生物技术有限公司合成。Stat3引物序列上游为：5′-TCT CCT ACT TCT GCT ATC TTT GAG-3′，下游为：5′-ATG GGT CTC AGA GAA CAC ATC-3′，扩增片段为116bp；CyclinD1引物序列上游为：5′-CCA GTG ACA AAC CAT CCA GT -3′，下游为：5′-GGA TAT TCC CAA ACC ATT CC-3′，扩增片段为371bp；内参GAPDH引物序列上游为：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游为：5′-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3′，扩增片段长度为180bp。

1.3 stat3、cyclinD1 mRNA表达水平测定 癌组织及癌旁正常组织切取后立即投入液氮中，转移至-86℃冰箱中保存备用。采用RNA提取试剂盒从冰冻标本提取总RNA。按逆转录试剂盒说明，吸取2μl RNA样本在20μl反应体系中进行逆转录反应。PCR反应体系为25μl，stat3、cyclinD1和GAPDH在同一反应体系中扩增。Stat3扩增条件为：94℃变性50s，56℃退火50s及72℃延伸1min，共进行32个循环（第6个循环末暂停，加入GAPDH引物）。CyclinD1扩增条件为：94℃变性50s，55℃退火50s及72℃延伸1min，共进行30个循环（第5个循环末暂停，加入GAPDH引物）。取10μl扩增产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳后，紫外线灯下观察摄片，扫描后在ImageMasterVDS凝胶成像分析系统下进行分析。每个样本stat3、cyclinD1目的扩增片断吸光度（A）值与相应的内参GAPDH扩增片段的A值之比为stat3、cyclinD1 mRNA表达水平的定量指标。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件，所得数据均以表示，组间比较采用配对t检验，stat3和cyclinD1表达的相关性采用Pearson直线相关分析，stat3 mRNA表达与各临床指标的相关关系采用多元线性回归分析。

2 结果

2.1 鳞癌组织及相应正常组织中stat3、cyclinD1 mRNA的表达情况 鳞癌组织中stat3及cyclinD1mRNA表达的电泳图见图1-2。鳞癌组织中stat3及cyclinD1mRNA的表达水平分别为0.77±0.32、0.78±0.58，相应正常组织中stat3及cyclinD1mRNA的表达水平分别为0.56± 0.23、0.49±0.40，鳞癌组织中stat3及cyclinD1mRNA的表达水平均明显高于相应正常组织的表达（P＜0.05或 0.01）。鳞癌组织中stat3mRNA的表达与cyclinD1mRNA的表达无明显相关（P＞0.05）。

图1 鳞癌组织中stat3表达的电泳图

图2 鳞癌组织中cyclinD1表达的电泳图

2.2 stat3、cyclinD1 mRNA的表达与口腔鳞癌患者临床特征的关系 见表1。

表1 stat3、cyclinD1 mRNA的表达

由表1可见，stat3、cyclinD1 mRNA的表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移明显相关（P＜0.05），而与性别、年龄、发生部位、肿瘤大小和病理分级之间无明显相关（均P＞0.05）。

3 讨论

基因改变及细胞周期的调控异常是细胞癌变过程中密切相连、不可分割的两个分子事件。细胞周期调控异常导致细胞的持续增殖，是肿瘤发生的生物学基础。已有研究表明，cyclinD1表达增高是由于基因转录水平的缺陷，结构上激活的stat3能在转录水平上调cyclinD1的表达。stat3激活和cyclinD1蛋白水平之间的可能联系已于头颈鳞癌中得到阐明[2，4-5]。头颈鳞癌TGF-α/EGFR自分泌途径中stat3的畸变激活，可以通过cyclinD1过表达在某种程度上促进肿瘤的恶变。

Nagpal等[6]对口腔癌组织标本中激活的stat3蛋白（p-stat3）表达的研究发现，癌旁正常上皮组织表达p-stat3，p-stat3在T1、T2分期的肿瘤组织中高表达，而在T3、T4分期的肿瘤中表达逐渐减少，表明stat3在早期行使信号转导和转录激活功能，随着细胞向恶性转化，其表达逐渐减少；RT-PCR示stat3 mRNA在T1、T2分期的肿瘤组织中高表达，T3分期减少，T4分期又增高。本研究结果显示，stat3 mRNA在口腔鳞癌相应正常组织中有表达，与癌组织的表达之间的差异有统计学意义，这说明stat3 mRNA在口腔鳞癌形成早期即可部分行使信号转导和转录激活功能，在肿瘤组织中这种功能更活跃。这与Napal等的研究结果一致。本研究还表明，口腔鳞癌组织stat3 mRNA表达与与性别、年龄、发生部位、肿瘤大小、病理分级等临床指标无明显相关，但与淋巴结转移、肿瘤分期有明显相关性，在T1～T4分期的肿瘤组织stat3 mRNA表达水平逐渐增高，推测stat3 mRNA的表达可能有助于口腔鳞癌淋巴结转移和肿瘤临床分期的预测。

cyclinD1是参与细胞周期性G1/S转换的重要正性调节因子[3]，正常情况下它在G1期是恒定的，其过度表达使细胞周期G1/S转换时间缩短，细胞分裂速度加快，促进细胞周期的进程和细胞过度增殖，导致细胞癌变。cyclinD1基因目前已被证实是与肿瘤有最直接关系的癌基因[3，7-8]，在食管癌、喉癌、乳腺癌等多种肿瘤均有cyclinD1的基因扩增和过度表达，且cyclinD1过表达与头颈部肿瘤的局部复发、淋巴结转移及临床分期相关。本研究结果显示，口腔鳞癌的相应正常组织和癌组织中cyclinD1 mRNA的表达差异有统计学意义，癌组织中的表达明显高于相应正常组织，说明肿瘤生殖旺盛，与其生长失控的特点相吻合，而其相应正常组织处于相对正常的细胞增殖状态。鳞癌发生、发展过程中cyclinD1过表达，加速了细胞周期转换，而细胞的快速分裂，导致肿瘤形成。

本文结果还显示，stat3 mRNA与cyclinD1 mRNA的表达无明显相关，推测口腔鳞癌发生、发展中stat3基因在mRNA水平上对cyclinD1的调控作用不明显。由于本研究从mRNA水平研究发现stat3对cyclinD1转录调节并未发生变化，而已有的研究证实癌变过程中发挥作用的是p-stat3，故口腔鳞癌中stat3激活提高转录水平和cyclinD1上调之间的关系尚有待进一步深入研究。

[1]Bao G Q,Shen B Y,Pan C P,et al．Andrographolide causes apoptosis via inactivation of STAT3 and Akt and potentiates antitumor activity of gemcitabine in pancreatic cancer[J]．Toxicol Lett, 2013,222(1):23-35．

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[4]Masuda M,Suzui M,Yasumatu R,et al．Constitutive activation of signal transducers and activators of transcription 3 correlates with cyclin D1 overexpression and may provide a novel prognostic marker in head and neck squamous cell carcinoma[J]．Cancer Res,2002,62(12):3351-3355．

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（本文编辑：欧阳卿）

《浙江医学》对医学论文中有关实验动物描述的要求

在医学论文的描述中，凡涉及实验动物者，在描述中应符合以下要求：（1）品种、品系描述清楚，（2）强调来源，（3）遗传背景，（4）微生物学质量，（5）明确等级，（6）明确饲养环境和实验环境，（7）明确性别，（8）有无质量合格证，（9）有对饲养的描述（如饲料型、营养水平、照明方式、温度、温度要求），（10）所有动物数量准确，（11）详细描述动物的健康状况，（12）对动物实验的处理方式有单独清楚的交代，（13）全部有对照，部分可采用双因素方差分析。

本刊编辑部

Expression of stat3/cyclinD1 pathway in oral squamous cell carcinoma and its significance

Objective To determine the expression and clinical significance of stat3/cyclinD1 pathway in oral squamous cell carcinoma(OSCC)．MethodsTissue specimens of carcinoma and matched normal mucosa were taken from 35 patients with OSCC．The mRNA expression of stat3 and cyclinD1 in tissue specimens were determined by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)．ResultsThe mRNA expression of stat3 and cyclinD1 gene in OSCC were significantly higher than that in normal mucosa(P＜0．05)．The expression of stat3 and cyclinD1 mRNA in OSCC was correlated with lymph node metastasis and clinical stages of tumor(P＜0．05),while was not correlated with sex,age,tumor location,tumor size and pathological grade (P＞0．05)．There was no correlation between expression of stat3 and cyclinD1 mRNA in OSCC tissue specimens (P＞0．05)．ConclusionDetermination of stat3 and cyclinD1 gene expression may contribute to predict lymph node metastasis and clinical stage of oral squaremous cell carcinoma．The results indicate that stat3 gene may not involve in regulation of cyclinD1 expression in the development of OSCC．

stat3 cyclinD1 Mouth Squamous cell Carcinoma mRNA

2013-11-08）

310003 杭州市红十字会医院口腔科

洪滔，E-mail：htown@163.com