吴芳 余胜 芮韬 何琦文 钱晓宇 何徐军 陶厚权 马英玉 赵仲生叶再元

●论 著

ARID2在胰腺癌组织中表达的临床研究

吴芳 余胜 芮韬 何琦文 钱晓宇 何徐军 陶厚权 马英玉 赵仲生叶再元

目的探讨ARID2在胰腺癌与癌旁组织中的表达情况及其与胰腺癌临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学SP法,检测60例胰腺腺癌及其癌旁组织中ARID2的表达情况，并结合临床病理资料进行统计分析。结果ARID2主要表达于细胞核。胰腺癌组织中ARID2阳性表达19例（31．7%），癌旁正常组织中ARID2阳性表达46例（76．7%），差异有统计学意义（P＜0．01）。胰腺癌组织中ARID2的表达与肿瘤分化程度、分期、淋巴转移及远处转移明显相关（均P＜0．05），但与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位无相关性（均P＞0．05）。结论ARID2在胰腺癌中低表达，且其表达程度与胰腺癌进展呈负相关，提示其可能在胰腺癌发生、发展中发挥抑癌作用，是胰腺癌预后的良好指标，可为临床诊治提供一定的参考依据。

胰腺癌 ARID2 预后

胰腺癌恶性程度高、进展快、预后差，占全球癌症死亡原因的第四位，其5年生存率低于5%，且近50年来无明显改善[1]。胰腺癌的起病较隐匿，确诊的胰腺癌患者中仅约20%的肿瘤较局限可以行外科切除，近80%则因发生转移等无法切除[2]。行手术切除并辅以化疗的胰腺癌患者，术后平均存活12～22个月，其5年生存率为20%～25%[3]。近年来的研究表明，胰腺癌的发生、发展是一个复杂的多阶段过程，与癌基因表达失常或抑癌基因失活有关，其中染色质重塑复合物的突变与肿瘤的发生密切相关[4]。AT-rich interactive domain 2（ARID2）是从P月AF（一种参与依赖配体的核受体转录激活的SWI/ SNF染色质重塑复合物）中被分离鉴定的[5]，作为抑癌基因参与多种肿瘤的发生、发展，如在肝癌、肺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤中都发现了其失活突变。然而，ARID2与胰腺癌相关性的研究较少，在胰腺癌发生、发展中的作用尚不清楚。本研究通过免疫组织化学SP法检测ARID2在胰腺癌与癌旁组织中的表达情况，旨在探讨ARID2在胰腺癌组织中的表达及意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2006-01—2013-01在浙江省人民医院接受手术并切除的胰腺癌组织及相应癌旁组织标本各60例，均经常规HE染色和免疫组织化学检测明确诊断，术前未作化疗、放疗。胰腺癌患者中男28例，女32例，年龄35～88（62.82±11.76）岁；按美国癌症联合委员会（AJCC）胰腺癌TNM分期（2010版）：Ⅰ期7例，Ⅱ期25例，Ⅲ期2例，Ⅳ期26例；分化程度：高分化12例，中分化26例，低分化22例；有淋巴结转移31例，无淋巴结转移29例；远处转移26例，无远处转移34例。

1.2 主要试剂 小鼠抗人ARID2单克隆抗体 [购于美国Santa Cruz公司，ARID2（E-3）：sc-166117]；即用型免疫组化超敏SP试剂盒（SP-9000）和二氨基联苯胺（DA月）显色剂（均购于北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 免疫组化染色 石蜡包埋组织连续切片，厚度为4μm，60℃烤片2h，常规二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，蒸馏水浸泡，高压锅抗原修复3min。室温下冷却30min，3%H2O2室温下孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性，P月S漂洗3min×3次。滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育15min，倾去，勿洗。滴加稀释度为1：50的ARID2抗体（稀释剂为P月S）；阳性对照为已知阳性的胰腺癌组织，以P月S代替一抗作阴性对照。4℃冰箱中过夜。第2天取出后P月S漂洗3min×3次，滴加试剂月（黄色液体），室温孵育15min，P月S漂洗3min×3次。滴加试剂C（橙色液体）室温孵育15min，P月S漂洗3min× 3次，DA月显色3min左右，蒸馏水漂洗，苏木素复染细胞核，中性树胶封片。

1.4 结果判断 由2位有经验的病理科医师采用双盲法对染色情况进行判断。ARID2主要在细胞核表达，根据染色强度与阳性细胞比例综合计分，细胞的染色强度可分为0分（染色阴性）、1分（淡黄色颗粒）、2分（棕黄色颗粒）、3分（褐色颗粒）；阳性细胞比例评分方法：0分（阳性细胞比例≤5%）、1分（5%＜阳性细胞比例≤25%）、2分（25%＜阳性细胞比例≤50%）、3分（50%＜阳性细胞比例≤75%），4分（75%＜阳性细胞比例≤100%）。根据两项乘积的分数分类，分数≤4记为ARID2表达阴性，分数＞4记为ARID2表达阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，率的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 ARID2在胰腺癌组织及癌旁正常组织中的表达情况 ARID2主要表达于细胞核。胰腺癌组织中ARID2阳性表达（图1）19例（31.7%），癌旁正常组织中ARID2阳性表达（图2）46例（76.7%），差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 ARID2在胰腺癌组织的表达情况（A：SP法，×200；B：SP法，×400）

图2 ARID2在胰腺癌旁正常组织中的表达（A：SP法，× 200，B：SP法，×400）

2.2 胰腺癌组织中ARID2的表达水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系见表1。

由表1可见，胰腺癌组织中ARID2的表达与肿瘤分化程度、分期、淋巴转移及远处转移明显相关（均P＜0.05），但与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位无相关性（均P＞0.05）。

3 讨论

ARID2属于ARID家族，是从一种参与依赖配体的核受体转录激活的SWI/SNF染色质重塑复合物P月AF中被分离鉴定出来的[5]。SWI/SNF复合物是一种进化保守的多亚单位的染色质重塑复合物，对染色质重塑起着决定性作用，能够利用ATP水解产生的能量动员核小体，使染色质重构，从而调节靶基因的转录，控制多种生物学过程包括细胞增殖和生长抑制[6]。越来越多的研究证实了这种复合物在肿瘤发生中的作用，它的几个亚单位具有内在的肿瘤抑制因子活性，或者是肿瘤抑制基因激活所必须的。

染色质重塑通过影响核小体结构，为其他蛋白提供和DNA的结合位点，是表观遗传修饰模式中的一种重要机制，染色质重塑复合物若发生突变，可导致染色质不能重塑，影响基因的正常表达，导致疾病发生。若突变引起抑癌基因或调节细胞周期的蛋白出现异常，则可能会导致肿瘤的发生和发展。Gui等[4]推测，染色质重塑异常可能是导致膀胱癌发生的一个重要原因，其在97例膀胱移行细胞癌患者中检测到59%的患者含有染色体重塑相关基因，其中就包括ARID2基因。Fujimoto等[7]对肝癌的全基因组测序也发现，约50%的肿瘤中存在ARID2突变。Li等[8]对129例肝细胞肝癌患者外显子组测序并对比，发现其中18.2%携带有丙型肝炎病毒的肝细胞肝癌患者的染色质重塑基因ARID2发生了失活性突变。推测其可能原因为，ARID2的钝化突变可抑制干扰素-α诱导的Jak-STAT信号肽，进而促使慢性丙肝向HCV相关性肝细胞肝癌转化。另外，在肺癌及黑色素瘤中也发现了ARID2的失活性突变[9-10]。以上说明，ARID2基因失活性突变与多种肿瘤的形成密切相关。在胰腺癌的发生、发展中，月iankin等[11]利用基因测序和拷贝数分析的方法发现了新的突变基因，其中就包括参与染色质重塑的ARID2，但ARID2所起的作用尚不清楚，尤其是其与临床病理特征的关系尚未见报道。

表1 胰腺癌组织中ARID2的表达水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系（例）

本研究结果显示，ARID2在胰腺癌组织中的阳性表达率显著低于癌旁组织；在胰腺癌组织中ARID2的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位等无明显相关性，而与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴转移与否明显相关，这预示着ARID2的表达失活可能导致肿瘤恶化及转移。分析其可能原因为ARID2发生突变，导致染色质不能重塑，引起抑癌基因或调节细胞周期的蛋白出现异常，从而导致肿瘤的发生和发展，但是其具体机制还有待于进一步研究。由此可见，ARID2的表达与胰腺癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移呈负相关，可考虑将其作为评估胰腺癌转移潜能及判断预后的指标之一，也将为胰腺癌的基因靶向治疗提供新的思路。

[1]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al．Cancer statistics[J]．CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300．

[2]Butturini G,Stocken D D,Wente M N,et al．Influence of resection margins and treatment on survival in patients with pancreatic cancer:meta-analysis of randomized controlled trials[J]．Arch Surg,2008,143(1):75-83．

[3]Neoptolemos J P,Stocken D D,Bassi C,et al．Adjuvant chemotherapy with fluorouracil plus folinic acid vs gemcitabine following pancreatic cancer resection:a randomized controlled trial[J]．JAMA,2010,304(10):1073-1081．

[4]Gui Y,Guo G,Huang Y,et al．Frequent mutations of chromatin remodeling genes in transitional cell carcinoma of the bladder[J]．Nat Genet,2011,43(9):875-878．

[5]Yan Z,Cui K,Murray D M,et al．PBAF chromatin-remodeling complex requires a novel specificity subunit,BAF200,to regulate expression of selective interferon-responsive genes[J]．Genes Dev,2005,19(14):1662-1667．

[6]Reisman D,Glaros S,Thompson E A．The SWI/SNF complex and cancer[J]．Oncogene,2009,28(14):1653-1668．

[7]Fujimoto A,Totoki Y,Abe T,et al．Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators[J]．Nat Genet, 2012,44(7):760-764．

[8]Li M,Zhao H,Zhang X,et al．Inactivating mutations of the chromatin remodeling gene ARID2 in hepatocellular carcinoma[J]．Nat Genet,2011,43(9):828-829．

[9]Manceau G,Letouze E,Guichard C,et al．Recurrent inactivating mutations of ARID2 in non-small cell lung carcinoma[J]．Int J Cancer,2013,132(9):2217-2221．

[10]Hodis E,Watson I R,Kryukov G V,et al．A landscape of driver mutations in melanoma[J]．Cell,2012,150(2):251-263．

[11]Biankin A V,Waddell N,Kassahn K S,et al．Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes [J]．Nature,2012,491(7424):399-405．

Clinical study on expression of ARID2 in pancreatic carcinoma

ObjectiveTo examine the expression level of ARID2 in pancreatic cancer and analyze its relationship with clinicopathological features of pancreatic cancer．MethodsImmunohistochemistry was used to detect ARID2 expression in 60 pancreatic cancer tissue and tumor-adjacent tissue specimens．The correlation between ARID2 and clinicopathological features of pancreatic cancer was analyzed．ResultsThe positive rate of ARID2 expression was significantly lower in pancreatic cancer than in tumor-adjacent tissue(31．7%vs 76．6%,P＜0．05)．ARID2 expression was negatively correlated with tumor stage,differentiation,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．05),but showed no significant correlation with sex,age,tumor size and location(P＞0．05)．ConclusionDown-regulation of ARID2 expression in pancreatic cancer may contribute to tumor metastasis and development．ARID2 might be a marker for favorable prognosis as a tumor suppressor,which may provide experimental basis for diagnosis and treatment of pancreatic cancer．

Pancreatic cancer ARID2 Prognosis

2013-09-04）

（本文编辑：欧阳卿）

国家自然科学基金资助（81071991、81372598）

310014 杭州，浙江省人民医院胃肠外科（吴芳、余胜、芮韬、何琦文、钱晓宇、陶厚权、叶再元），病理科（赵仲生），浙江省胃肠病学重点实验室（何徐军、马英玉）

叶再元，E-mail：zaiyuanye@163.com