陈俊 王伟林

层粘连蛋白332α3链的表达模式与胰腺癌的关系

陈俊 王伟林

目的 检测胰腺癌组织中层粘连蛋白332α3链（Laminin 332 α3，LNα3）的阳性表达水平，探讨其表达模式与胰腺癌的关系。方法应用免疫组织化学方法（Envision法）检测65例胰腺癌标本中LNα3蛋白的表达情况，以癌旁正常组织作为对照，并分析胰腺癌组织中LNα3蛋白不同表达模式[单一胞质表达（SCT）与胞质/间质共表达（CMT）]与胰腺癌临床病理特征及预后的关系。结果65例胰腺癌组织中LNα3蛋白的阳性表达率100%，显著高于癌旁正常组织（1．6%），差异有统计学意义（P＜0．01）。其中SCT 42例，CMT 23例。LNα3链的不同表达模式与胰腺癌肝转移、血管浸润、胆管浸润均有关（P＜0．05或0．01），胞质/间质的共表达预示胰腺癌患者较高的肝转移率、血管浸润及胆管浸润的风险。肝转移、临床分期、十二指肠浸润和肿瘤位置与胰腺癌患者的生存期明显相关（P＜0．05或0．01），肿瘤位置和临床分期是预测生存期的独立因素（P＜0．05），肿瘤位于胰体尾或临床分期越高的预后差，肝转移、浆膜侵犯、十二指肠浸润均不能作为独立的预测因素（均P＞0．05）。结论LNα3的表达与胰腺癌的发生、侵袭、转移密切相关，尤其是胞质/间质的共表达可作为判断胰腺癌肝转移、血管浸润、胆管浸润的重要参考指标。但是影响胰腺癌预后的因素较多，需要结合各种因素综合判断。

胰腺癌 层粘连蛋白332α3 免疫组织化学 表达模式

层粘连蛋白是α、β、γ链组成的异三聚体蛋白，常 见于基底膜，可以通过整合素和其他细胞表面受体促进细胞的黏附和迁移，其与肿瘤转移的关系已成为近年来研究的热点。但目前关于胰腺癌患者层粘连蛋白表达情况的研究较少，尤其是α3链与胰腺癌的相关研究尚未见报道。因此本研究采用免疫组织化学方法检测胰腺癌组织中层粘连蛋白332α3链（LNα3）蛋白的表达情况，探讨其与胰腺癌的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2010-01—2012-06在浙江大学医学院附属第一医院行根治性手术切除的胰腺癌患者石蜡标本65例，以癌旁非肿瘤胰腺组织石蜡标本63例（另2例未找到癌旁非肿瘤胰腺组织）作为正常对照。所有标本切除后即用10%中性福尔马林固定，并由2位高年资病理医师证实为胰腺导管腺癌及非肿瘤胰腺组织，并按照WHO组织学分级标准对胰腺癌的分化程度进行修正。同时记录65例患者的年龄、性别，肿瘤大小、位置、TNM分期、神经侵犯、脉管浸润、肝转移等临床病理资料并进行随访。65例胰腺癌中男62例，女34例，年龄41～80岁，中位年龄62岁。随访截止日期为2013年4月，生存期的计算从手术日期到随访截止日期，或由于复发、转移而死亡的日期为止，截尾值为0。所有患者术前均未行放、化疗。

1.2 方法 免疫组织化学染色Envision法：一抗为兔抗人多克隆Laminin332 α3（Santa Cruz Biotechnology，USA），二抗为抗鼠/兔通用抗体（Dako Invitrogen，USA）。标本经10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋后切片。切片厚度4μm，常规HE染色。石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，P月S冲洗3次，甲醇过氧化氢阻断10min，柠檬酸修复抗原，P月S冲洗3次，滴加一抗α3（稀释度1∶100），以P月S代替一抗做阴性对照，4℃冰箱过夜，P月S冲洗3次后滴加二抗，室温孵育30min，P月S冲洗3次后，滴加DA月显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察。

1.3 观察指标 结果判断以肿瘤细胞的胞质及间质内出现棕黄色细颗粒为阳性。肿瘤细胞的阳性根据染色程度和染色细胞百分率进行评定和分析：基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；着色细胞占计数细胞的百分率≤5%记0分，6%～25%记1分，26%～50%记2分，≥51%记3分。将每张切片的染色程度与染色细胞百分率得分各自相乘，为其最后得分。≤1分为阴性，≥2分为阳性。间质阳性表达以肿瘤区域间质着色≥10%为阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS21.0统计软件，率的比较采用χ2检验，以Kaplan-Meier法进行生存分析，进行Log-rank检验，将单因素分析中有意义（即P＜0.05）的变量纳入多因素分析，采用Cox比例风险回归分析。

2 结果

2.1 LNα3的表达情况 65例胰腺癌组织均见LNα3的表达，阳性表达率100%，而非肿瘤胰腺组织中仅1例可见LNα3的表达，阳性表达率1.6%，差异有统计学意义（P＜0.01）。阳性表达主要在胰腺导管上皮的胞质、基底膜和间质中，可观察到阳性强度与肿瘤的分化程度相关，肿瘤的浸润前缘、出芽区及分化越低的区域，LNα3的染色越强。同时，鳞状细胞癌分化的癌巢，其LNα3往往在癌巢边缘癌细胞的胞质中表达特别强，中央弱或失表达。部分肿瘤在其浸润区域的间质中LNα3的表达呈絮状及团块状分布。根据表达模式的不同，LNα3在胰腺癌中的表达被分为两种类型：单一胞质表达类型（SCT，42例）和胞质/间质共表达类型（CMT，23例）。LNα3单一胞浆的表达在肿瘤的浸润前缘与出芽区往往强阳性（图1-3），LNα3胞质/间质共表达，基膜物质不仅见于胞质，在间质并呈絮状及团块状沉积（图4-6）。

2.2 LNα3的表达模式与胰腺癌患者临床病理特征的关系 见表1。

图1 低分化腺癌中LNα3单一胞质的表达，浸润前缘见肿瘤出芽，LNα3染色强（HE染色，×200，下同）

图2 鳞癌分化区域，LNα3单一胞质的表达，浸润前缘见肿瘤出芽，LNα3在癌巢边缘癌细胞的胞质中表达特别强，中央弱表达

图3 淋巴结内癌组织，LNα3单一胞质的表达

图4 中分化腺癌中LNα3胞质和间质的共表达，基膜物质不仅见于胞质，并在局灶间质呈浓稠曲线状及絮状沉积

由表1可见，LNα3链的不同表达模式与胰腺癌肝转移、血管浸润、胆管浸润均有关（P＜0.05或0.01），胞质/间质的共表达预示胰腺癌患者较高的肝转移率、血管浸润及胆管浸润的风险。LNα3链的不同表达模式与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、十二指肠浸润、肿瘤分化、淋巴结转移、神经侵犯、浆膜侵犯、门静脉侵犯、切缘状况、临床分期均无明显相关性（均P＞0.05）。

图5 中分化腺癌中 LNα3胞质见阳性表达，间质内可见扩散破絮状阳性物质

图6 中分化腺癌中LNα3胞质见阳性表达，间质内可见浓稠曲线状及散在絮状阳性物质

2.3 胰腺癌患者预后影响因素分析

2.3.1 Kaplan-Meier单因素分析 见表2。

由表2可见，65例胰腺癌根治术后的中位生存期为10个月，1年与2年生存率分别为40%和21%。肝转移、临床分期、十二指肠浸润和肿瘤位置与胰腺癌患者的生存期明显相关（P＜0.05或0.01），而年龄、性别、肿瘤大小、胆管浸润、分化程度、淋巴结转移，神经侵犯、血管侵犯、浆膜侵犯、门静脉侵犯和切缘状况与生存期均无明显相关性（均P＞0.05）。SCT患者的中位生存时间10个月，CMT患者的中位生存时间12个月，CMT患者的中位生存时间略高于SCT患者，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3.2 Cox多因素分析 见表3。

由表3可见，肿瘤位置和临床分期是预测生存期的独立因素（P＜0.05），肿瘤位于胰体尾或临床分期越高的预后差，肝转移、浆膜侵犯、十二指肠浸润均不能作为独立的预测因素（均P＞0.05）。

3 讨论

表1 LNα3的表达模式与胰腺癌患者临床病理特征的关系[例（%）]

层粘连蛋白是细胞外基质的组成成分，可以促进构建上皮细胞的基底层结构和介导细胞黏附、生长、迁移、增殖和分化。在各种类型的肿瘤中，LN332能促进肿瘤细胞的迁移和入侵，如肝癌、结直肠癌、胃癌等，但目前报道较多的是LNγ2、LNβ3[1-4]。

目前，关于LNα3亚基在肿瘤中的研究报道较少，癌组织中很难检测到LNα3的表达[5-6]。本文结果显示，65例胰腺导管腺癌的癌细胞胞质内均见LNα3的表达，部分表达于基底膜或弥散在间质中，同时发现癌细胞胞质LNα3的阳性强度与肿瘤的分化程度相关，包括鳞状分化的区域，往往在肿瘤的浸润前缘、出芽区及分化越低，LNα3的染色越强，表明LNα3有助于癌细胞具有更强的侵袭能力，导致胰腺癌的进展。另外，层粘连蛋白在间质中的表达在不同分化的肿瘤组织中也是不同的，然而文献中绝大多数是关于γ2链的表达。在腺瘤组织中，层粘连蛋白在基底膜呈连续线性结构，甚至还有所增加[7]。在癌组织中，LN的α3和β3、γ2链表现出更多的破坏性的染色图案，尤其是在浸润区域呈现不连续、碎片状[3，8-10]。本研究发现LNα3的表达在部分增生导管或高分化腺管周围呈线性结构，但表达较弱，部分肿瘤在其浸润区域的间质中表达强，呈絮状及碎片状分布，这与上述文献报道相似。

表2 胰腺癌患者预后影响的单因素分析

表3 影响胰腺癌患者预后的多因素分析

有文献报道，LNγ2的表达模式被分类成细胞外型（E型），其特征是γ2的染色在细胞外基质，如基底膜和间质；另一型为细胞质型（C型），其特征是γ2的染色在肿瘤细胞的细胞质中。两种表达模式中C型是影响预后的因素[11]。Masuda等[12]对肺鳞状细胞癌局灶浸润中LNγ2链的表达进行研究，将LNγ2的免疫组化染色样本分为3个不同的类型：基底膜（月型;γ2位于基底膜层）、细胞质（C型；γ2位于细胞内的基质）和浸润前缘（F型；γ2位于细胞质中，并强烈表达于外围巢的一部分），结果显示F型比月型和C型与总生存率下降更相关，LNγ2的表达和肿瘤萌芽与肿瘤细胞的侵袭有关，是肺鳞状细胞癌患者死亡率的独立预测因子。Takahashi等[13]曾对胰腺导管癌LNγ2的表达部位和预后进行研究，发现所有胰腺导管癌患者均出现γ2链的表达，表达部位以胞质或基底膜为主，以胞质为主的表达模式与胰腺导管腺癌患者术后肝转移发生显著相关，也是生存期更低的最强预测因子。由于LNα3在癌细胞胞质均表达，但在基底膜区的表达较少且很弱，而部分癌组织中间质的表达较强，笔者将65例胰腺癌分为单一胞浆表达与胞浆/间质共表达两种类型，以观察LNα3的间质表达对预后的影响。结果显示，胰腺癌LNα3链的胞浆/间质共表达类型与肝转移、血管浸润、胆管浸润相关。但与Takahashi等[13]的研究结果不同的是，两种表达类型与胰腺导管腺癌患者的生存期均无关。另外，尽管Ito和Takahashi等的文献中都提到γ2链的细胞质型与预后相关，而非基底膜或间质的表达，但笔者认为仍有疑问：（1）是否层粘连蛋白不同亚基α3与γ2之间存在表达模式的差异？（2）提及的γ2胞质型的表达模式是单一表达还是与基底膜或间质共表达？由于免疫组化观察标准的不同以及主观性的原因，结果评估也存在差异。

层粘连蛋白作为基底膜生物活性的一个重要组成成分，表达在正常上皮的基底膜区。但Miyazaki等[14]的研究发现，在肿瘤组织中瘤细胞与层粘连蛋白的作用较为复杂。肿瘤细胞和内皮细胞内层粘连蛋白的表达明显上调，但层粘连蛋白也能促进基质金属蛋白酶（MMP）的表达，MMP能降解基膜成分，从而有利于肿瘤细胞向周围组织的浸润及血管芽的新生。Oka等[6]推测，肿瘤组织中基底膜的层粘连蛋白被癌细胞或相邻基质细胞分泌的MMP降解，可能会导致浸润前缘LNγ2和LNβ3积累，从而在肿瘤的侵袭过程中发挥直接作用。Tani等[15]的研究表明，胰腺癌中LN以一个异常的方式在基底膜合成和沉积，浸润的细胞黏附于这个新的基底膜，并通过α3β1整合素受体识别LN而迁移。

综上所述，随着胰腺癌的进展，基底膜LNα3受蛋白酶降解呈不连续性或缺失，同时癌细胞分泌LNα3增强，LNα3在基底膜区重新合成和沉积，部分呈絮状及碎片状扩散于肿瘤间质，通过α3β1整合素受体导致胰腺癌细胞的迁移和/或侵袭能力的增加。基于当前的研究结果，笔者认为LNα3的表达与胰腺癌的发生、侵袭、转移密切相关，尤其胞质/间质的共表达可作为判断胰腺癌肝转移、血管浸润、胆管浸润的重要参考指标。但是影响胰腺癌预后的因素较多，需要结合各种因素综合判断。另外，LNα3在胰腺癌间质中过度表达的机制尚不明确，进一步的分析是必要的，可能为胰腺癌的治疗提供一个新的分子靶向。

[1]Giannelli G,Fransvea E,Bergamini C,et al．Laminin-5 chains are expressed differentially in metastatic and nonmetastatic hepatocellular carcinoma[J]．Clin Cancer Res,2003,9(10 Pt 1): 3684-3691．

[2]Sordat I,Bosman F T,Dorta G,et al．Differential expression of laminin-5 subunits and integrin receptors in human colorectal neoplasia[J]．J Pathol,1998,185(1):44-52．

[3]Koshikawa N,Moriyama K,Takamura H,et al．Overexpression of laminin gamma2 chain monomer in invading gastric carcinoma cells[J]．Cancer Res,1999,59(21):5596-5601．

[4]Akimoto S,Nakanishi Y,Sakamoto M,et al．Laminin 5 beta3 and gamma2 chains are frequently coexpressed in cancer cells[J]．Pathol Int,2004,54(9):688-692．

[5]Ii M,Yamamoto H,Taniguchi H,et al．Co-expression of laminin β3 and γ2 chains and epigenetic inactivation of laminin α3 chain in gastric cancer[J]．Int J Oncol,2011,39(3):593-599．

[6]Oka T,Yamamoto H,Sasaki S,et al．Overexpression of beta3/gamma2 chains of laminin-5 and MMP7 in biliary cancer[J]．World J Gastroenterol,2009,15(31):3865-3873．

[7]Haas K M,Berndt A,Stiller K J,et al．A comparative quantitative analysis of laminin-5 in the basement membrane of normal,hyperplastic,and malignant oral mucosa by confocal immunofluorescence imaging[J]．J Histochem Cytochem,2001,49(10):1261-1268．

[9]Henning K,Berndt A,Katenkamp D,et al．Loss of laminin-5 in the epithelium-stroma interface:an immunohistochemical marker of malignancy in epithelial lesions of the breast[J]．Histopathology,1999,34(4):305-309．

[10]Lenander C,Habermann J K,Ost A,et al．Laminin-5 gamma 2 chain expression correlates with unfavorable prognosis in colon carcinomas[J]．Anal Cell Pathol,2001,22(4):201-209．

[11]Ito E,Ozawa S,Kijima H,et al．Clinicopathological significance of laminin-5γ2 chain expression in superficial esophageal cancer[J]．Dis Esophagus,2012,doi:10．1111/j．1442-2050．2012．01416．x．

[12]Masuda R,Kijima H,Imamura N,et al．Laminin-5γ2 chain expression is associated with tumor cell invasiveness and prognosis of lung squamous cell carcinoma[J]．Biomed Res,2012,33 (5):309-317．

[13]Takahashi S,Hasebe T,Oda T,et al．Cytoplasmic expression of laminin gamma2 chain correlates with postoperative hepatic metastasis and poor prognosis in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma[J]．Cancer,2002,94(6):1894-1901．

[14]Miyazaki K．Laminin-5(laminin-332):Unique biological activity and role in tumor growth and invasion[J]．Cancer Sci,2006,97 (2):91-98．

[15]Tani T,Lumme A,Linnala A,et al．Pancreatic carcinomas de-posit laminin-5,preferably adhere to laminin-5,and migrate on the newly deposited basement membrane[J]．Am J Pathol,1997, 151(5):1289-1302．

Expression pattern of laminin 332α3 chain is correlated with invasion and metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma

Objective To investigate the protein expression level of laminin 332α3 chain(LNα3)and the correlation of its expression pattern with pancreatic carcinoma．MethodsThe expression level and pattern of LNα3 were detected by immunohistochemistry with EnVision method in 65 pancreatic carcinoma specimens and adjacent normal tissues．The correlation of LNα3 expression and its pattern with clinicopathologic features and prognosis was analyzed．ResultsThe positive rate of LNα3 was significantly higher in 65 pancreatic carcinoma specimens(100．0%)than that in adjacent normal tissues(1．6%,P＜0．01)．The single cytoplasmic expression type(SCT)was presented in 42 cases and the cytoplasmic/mesenchymal coexpression type(CMT)was in 23 cases．The different expression patterns of LNα3 were associated with hepatic metastasis and vascular invasion and bile duct invasion(P＜0．05 or 0．01)and the CMT type indicated a higher risk．The overall survival of patients was significantly correlated with hepatic metastasis,T stages,duodenal invasion and tumor location(P＜0．05 or 0．01)．Tumor location and T stage were independent predictors of overall survival(P＜0．05)．The tumor location and higher clinical stages were correlated with poor prognosis,while hepatic metastasis and invasion to serosa and duodenal invasion were not the independent predictors (P＞0．05)．ConclusionThe expression of LNα3 is closely correlated with pancreatic carcinoma and its invasion and metastasis, especially the CMT type can be used as an important prognostic index．

Pancreatic carcinoma Laminin332α3 Immunohistochemistry Expression type

2013-07-09）

（本文编辑：欧阳卿）

卫生公益性行业科研专项经费项目：胰腺癌早期诊断与综合治疗的转化医学研究（201202007）

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科（陈俊系在职研究生，现在金华市中心医院外科工作）

王伟林，E-mail：wam@zju.edu.cn