李晓玲，张 博，石正洪

（1.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030；2.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000）

亚低温对脑出血后血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ表达影响的研究

李晓玲1，张 博2，石正洪1

（1.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030；2.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000）

目的 通过观察亚低温对实验性脑出血后的血脑屏障（BBB）、BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的影响，进一步探讨亚低温减轻血管源性脑水肿的机制。方法 将健康雄性SD大鼠（54只）随机分为3组：生理盐水组、脑出血组和亚低温+脑出血组。采用自体血注入法建立脑出血模型，伊文思蓝浓度测定BBB通透性、脑水含量（干湿重法），观察各组大鼠BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达（免疫组化法）。结果 脑出血24 h后BBB通透性开始增加，72 h达高峰，7 d后开始下降，其变化趋势与脑水含量及BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达一致。亚低温+脑出血组的BBB通透性、脑水含量及BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达均低于脑出血组。结论 脑出血后血管源性脑水肿的形成与BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的高表达有关；亚低温可以通过减少其表达来减轻BBB通透性的增加，减轻脑水肿，进一步保护脑组织。

亚低温；脑出血；血脑屏障；Rho激酶Ⅱ

脑出血占急性脑血管病的20%~30%，急性期的病死率约30%~40%，是一种严重危害人类健康的疾病。脑出血后神经功能恶化最重要的原因是脑水肿的形成。血脑屏障（BBB）破坏是脑出血后脑水肿发生发展的一个重要病理生理过程[1]。目前有报道显示，Rho激酶的表达是导致炎症等多种病理反应过程中血管内皮通透性升高的原因之一[2]。亚低温已经被证实可以减轻脑出血后脑水肿[3]，但能否通过对脑出血后BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的变化产生影响尚未见相关报道。本实验通过观察采用自体血注入法建立的大鼠脑出血模型BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ表达的变化来探讨脑出血后脑水肿形成的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

SD雄性大鼠54只，鼠龄10～12个月，体重（275±25）g，由北京天坛医院动物房提供。将其随机分为3组：生理盐水组、脑出血组和亚低温＋脑出血组。每组又分为脑出血后24 h、72 h、7 d 3个亚组。

1.2 方法

1.2.1脑出血模型 大鼠术前4 h禁食，2 h禁水，用10%水合氯醛以400 mg/kg剂量腹腔麻醉，俯卧位固定于动物脑立体定位仪（美国Benchmark）上。头皮正中切口，切开皮肤，剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，前囟后1.0 mm、中线右3.0 mm处为注射穿刺点（右侧基底节区尾状核），用牙科钻穿透颅骨，用微量注射器（宁波三爱）抽取股动脉血50 ul，将注射器固定于立体定位仪上，将针尖置于穿刺点平颅骨，垂直进针5.5 mm后，以微量注射泵（美国Benchmark）缓慢注入自体血。生理盐水组与脑出血组同样定位穿刺，注入50 μl生理盐水。

1.2.2亚低温处理具体方法 进行亚低温治疗6 h。大鼠采用冰块、医用冰毯（大连欧姆龙）降温，体温采用肛温法测定，用医用电子温度计（大连欧姆龙）间隔15 min监测肛温。亚低温+脑出血组在脑出血后10 min内将大鼠放在冰毯上用冰块覆盖降温，约15 min左右降至（33.0±1.0）℃，脑出血组及生理盐水组肛温维持在（37.5±1.0）℃，并在大鼠苏醒后（一般为3 h左右）再次给予10%水合氯醛以150 mg/kg剂量腹腔麻醉。大鼠6 h后在室温下自动复温。

1.2.3冰冻切片制备 各组大鼠在出血后不同时间给予10%水合氯醛以400 mg/kg剂量腹腔麻醉，仰卧位固定于动物脑立体定位仪上，剪开胸腹腔，夹闭下腔静脉及胸主动脉，4%多聚甲醛溶液250 ml经心腔灌注固定，断头取脑，沿针孔冠状面切开，将针孔后脑标本置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，后用20%蔗糖溶液脱水固定72 h，在注射针道平面切取脑组织块后以冰冻切片机（Leica CM1850）行冰冻切片，每张厚度10 μm。

1.2.4 BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ免疫组化染色 按以下步骤进行免疫组化染色：（1）去除玻片上多余的水分，滴加3%过氧化氢抑制5 min；滴加一抗1∶100（羊抗小鼠PAR-1抗体），4℃放置过夜，0.1 mol/L PBS液冲洗5 min，反复3次。（2）滴加生物素标记的二抗（DAKO K0690），37℃放置30 min，0.1 mol/L PBS液冲洗5 min，反复3次。（3）滴加SABC，20~37℃放置30 min，0.1 mol/L PBS液冲洗5 min，反复3次。（4）DAB显色，0.1 mol/ L PBS液冲洗。（5）苏木素复染，脱水、透明、封片、镜检。在彩色图像分析仪上观察可见血肿周围微血管内皮细胞浆有棕黄色颗粒者为阳性细胞。

1.2.5脑水含量的测定 取血肿周围约150 mg脑组织在分析天平（200S）上称湿重，然后将组织放入电热烘箱中100℃烘烤24 h再称干重。按下列公式计算脑水含量：

水含量=（湿重-干重）/湿重×100%

1.2.6 BBB通透性测定 大鼠在各时间点处死前2 h经股静脉注入2%伊文思蓝溶液4 ml/kg，生理盐水灌注后断头取脑。滤纸吸干大脑表面水分，在穿刺点前后横切脑组织得到3 mm厚断面。去除皮层后称重，浸入2 ml 50%三氯乙酸中，37℃孵育3 d。每个样品各取2 ml在激发波长620 nm、发生波长680 nm的多功能酶标仪上测定伊文思蓝的荧光值。根据标准曲线，计算出伊文思蓝含量（μg/g脑组织）。

1.3 定量方法

采用彩色图像分析仪（BI－2000）进行分析，将脑切片置于高倍镜（400倍）下，在每张切片上随机选取血肿周围有毛细血管的5个视野，进行积分光密度测定。

1.4 统计方法

采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。数据用均数±标准差（±s）表示，计量资料两两比较，若方差齐用t检验，若方差不齐多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1模型成功标准

以脑组织中有明显的圆形、椭圆形或不规则的血肿存在为模型成功标准，血液针道反流进入脑室，大鼠死亡者均摒除。同时参照Longa及Bederson5级评分法，2～3分作为成功模型入组。符合制作成功要求的模型54只。

2.2 脑出血后BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达

血肿周围区的BBB内皮细胞上可见少量棕色颗粒。不同时间点比较：脑出血组Rho激酶Ⅱ表达于出血后24 h开始增加，72 h达到高峰，7 d后下降。3个时间点两两比较均P＜0.01。生理盐水组Rho激酶Ⅱ在各时间点的表达差异无显著性（P＞0.05）。同一时间点比较：亚低温+脑出血组Rho激酶Ⅱ的表达在24 h、72 h、7 d均低于脑出血组，差异有显著性（P＜0.05），见表1。

表1 各组BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ表达的定量检测结果（±s）

表1 各组BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ表达的定量检测结果（±s）

注：*、△分别表示与亚低温+脑出血组、生理盐水组在同时间点比较P＜0.01，P＜0.05；#表示脑出血组各时间点比较P＜0.05；▲表示生理盐水组各时间点比较P＞0.05

组别生理盐水组脑出血组亚低温＋脑出血组Rho激酶Ⅱ积分光密度24 h 72 h 7 d 432.15±123.32▲#2 035.01±732.75△#1 307.71±384.34△#496.12±147.07▲#3 809.60±962.19*##1 796.60±572.16##303.13±101.62 1 392.32±321.54 1 012.07±341.47▲#△#

2.3脑水含量的比较（见表2）

脑出血组大鼠注血后24 h脑水含量开始增加，72 h达到高峰，7 d后下降（P＜0.01）。亚低温+脑出血组的脑水含量在24 h、72 h、7 d均低于脑出血组（P＜0.01）。

表2 各组脑水含量检测结果（±s，%）

表2 各组脑水含量检测结果（±s，%）

注：*表示与亚低温+脑出血组在同时间点比较，P＜0.01，▲表示脑出血组各时间点比较P＜0.01

组别脑出血组亚低温+脑出血组24 h 72 h 80.58±0.41*▲78.52±0.57*▲83.38±0.37*▲80.61±0.51*▲7 d 79.56±0.46*▲77.54±0.33*▲

2.4 BBB通透性的比较（见表3）

表3 各组伊文思蓝含量的检测结果（±s,μg/g脑组织）

表3 各组伊文思蓝含量的检测结果（±s,μg/g脑组织）

注：*表示脑出血组与亚低温+脑出血组在同时间点比较P＜0.01，▲表示脑出血组各时间点比较P＜0.01

组别脑出血组亚低温+脑出血组24 h 72 h 11.63±0.25*▲8.21±1.45▲*14.67±1.97*▲10.16±1.21▲*7 d 9.78±0.39*▲6.98±0.67▲*

3 讨论

Rho激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，普遍表达在各种组织中。其有两种基本亚型，即Rho激酶Ⅰ和Rho激酶Ⅱ，其中Rho激酶Ⅱ在脑组织中表达很高。Rho激酶底物包括肌球蛋白轻链磷酸酶、肌球蛋白、ERM、LIM激酶和cofilin[4]。BBB的基本结构包括脑毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接、周细胞、基膜与胶质细胞终足。其中，脑毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接是BBB的关键部位[5]。脑出血后血肿可以引起BBB的破坏进而导致脑水肿的发生发展。研究表明，在兔蛛网膜下腔出血动物模型中，氧合血红蛋白介导的自由基反应是通过Rho激酶的表达而引起脑血管痉挛[6]。为进一步研究脑出血后Rho激酶是否参与了脑水肿的形成过程，本实验对Rho激酶Ⅱ的表达变化做了研究。

在本实验中采用自体血注入法建立了脑出血模型，取脑组织通过免疫组化法观察BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ表达的阳性率。在显微镜下可以看到血肿周围毛细血管壁内皮细胞上有棕色颗粒。出血后Rho激酶Ⅱ表达的变化同BBB通透性、脑水肿的变化一致（见表1、2）。生理盐水组Rho激酶Ⅱ表达在各时间点均低于脑出血组，这说明脑出血后产生的Rho激酶Ⅱ参与了脑水肿的形成。可能与脑出血后通过激活Rho激酶Ⅱ造成血管内皮细胞收缩引起通透性增加，破坏BBB造成的脑水肿有关。

亚低温可以通过多种途径来减轻脑出血后脑水肿，其中保护BBB，减轻其通透性是目前研究的热点。但能否通过对Rho激酶Ⅱ的变化产生影响尚未见相关报道。代大伟等发现局部亚低温可能是通过抑制凝血酶的毒性作用来减轻脑出血后脑水肿的形成及BBB通透性的破坏[7]。本研究为了更贴近脑出血的生理过程而采用自体血注入法，取脑组织后制作的脑切片用彩色图像分析仪分析可以发现亚低温+脑出血组的BBB内皮细胞上Rho激酶Ⅱ的积分光密度值与脑出血组在各个时间点（24 h、72 h、7 d）相比均P＜0.05。由此可见亚低温可能通过降低脑出血后Rho激酶Ⅱ的表达来减轻脑水肿发挥其脑保护作用，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。在实验中可以看到Rho激酶Ⅱ表达在BBB内皮细胞上，通过本实验可以推测亚低温减轻出血后血管内皮细胞通透性也是保护BBB的机制之一[8]。

通过本实验我们可以看到脑出血后血肿周围毛细血管壁上Rho激酶Ⅱ表达上调，其变化与脑水肿的变化一致，说明Rho激酶Ⅱ可能参与了脑出血后脑水肿的形成。同时，亚低温+脑出血组的Rho激酶Ⅱ表达下调，可以推测降低血肿周围BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达可能是其减轻脑水肿的机制之一，但具体机制还有待我们进一步研究。

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1671-1246（2014）17-0140-03