温晓婷,黄元铭,王智昊,任志鸿,卢 珊

金黄色葡萄球菌是常见的条件致病菌。国内已报道流行性腮腺炎、鼻腔术后、严重烧伤后和输液伴发金葡菌的感染或TSST-1的污染而发生毒性休克综合征(TSS)。TSS主要是由金葡菌分泌的TSST-1引起的罕见，但进展快，病死率高达4%～22%的疾病，表现为脱屑性红疹、发热、休克和迅速的多器官功能衰竭。TSST-1是超抗原，能激活多克隆T 细胞释放大量炎性细胞因子如IL-2、TNF-β和IFN-γ[1-2]。这些细胞因子的短时间大量释放导致炎症反应迅猛，疾病进展加快。

姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提炼出来的一种植物多酚，能通过抑制多种炎症介质的生成而发挥抗炎作用[3]。Schaefers报道姜黄素能够抑制TSST-1诱导的人阴道上皮细胞炎症因子的产生和提高兔阴道染毒所致的TSS的生存率[4]。TSST-1多数由直接或间接破损的皮肤黏膜入血引起感染。脾是血源性抗原免疫应答的主要场所。因此本研究拟通过超抗原刺激培养小鼠脾细胞建立TSST-1感染模型，并给予姜黄素，观察炎症因子的变化，为进一步探讨姜黄素对炎症性休克的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级C57BL/6近交系小鼠，雌性，6～8周，购自北京大学医学部-北京华阜康生物科技股份有限公司。姜黄素和TSST-1购自Sigma公司，用二甲基亚砜溶解姜黄素粉末，配制成100 mmol/L的储存液，-80 ℃保存备用；RPMI1640培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；细胞毒性检测试剂盒购自Promega公司；小鼠IL-12抗体与TNF-α、IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ的ELISA检测试剂盒与流式细胞检测试剂盒均购自BD公司。

1.2方法

1.2.1小鼠脾脏淋巴细胞悬液的制备 颈椎脱臼法处死小鼠，无菌分离脾脏，两只脾脏为一组，用40 μm细胞滤网研磨，收集研磨液离心后弃上清，用1 mL RPMI1640重悬，加入4 mL红细胞裂解液(Gey’s solution)作用1 min后，在离心管底部加入1 mL胎牛血清以保护细胞，离心弃上清，用RPMI1640洗涤两次，用含浓度为10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞浓度。

1.2.2脾细胞的刺激 将4×106个的细胞接种于24孔培养板。分为TSST-1组(0.1 μg/mL、1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL)、TSST-1+姜黄素组(1 μg/mL TSST-1和1 μmol/L、6 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L姜黄素)、阴性对照组和阳性对照组(4 h和24 h为100 ng/mL LPS，48 h为5 μg/mL ConA)；LPS组(100 ng/mL)，TSST-1组(3 μg/mL)和TSST-1(3 μg/mL)+姜黄素组(15 μmol/L)的IL-12抗体组和非IL-12抗体组。培养相应时间后(潮湿、37 ℃、5% CO2)离心(1 400 r/min，8 min, 4 ℃)收集上清,冻存于-80 ℃冰箱，用于ELISA检测。

1.2.3细胞毒性检测(LDH 释放法) 细胞培养48 h, 终止前1 h于最大量释放孔加入110 μL细胞裂解液，分自然释放量组，试验组和最大释放量组。分别取50 μL上清于96孔板，设复孔，再加入50 μL底物混合物，充分混匀，封板避光作用30 min后终止，酶标仪读取490 nm处OD值；

计算公式如下：

1.2.4ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-12、IL-2和 IFN-γ 收集不同组4 h的细胞培养上清用于TNF-α的检测；收集24 h的上清检测IL-6；收集48 h的上清检测IL-12、IL-2和 IFN-γ，实验步骤按试剂盒说明书进行。根据标准品吸光度值，求出标准曲线回归方程，将样品吸光度值带入标准曲线并乘以相应的稀释倍数，计算出相应细胞因子浓度。

1.2.5流式细胞仪检测TNF-α 细胞培养24 h,终止前4 h在每孔细胞中加入PMA(终浓度为5 ng/mL)与Ionomycin(终浓度为500 ng/mL)培养1 h后，每孔加入1 μL蛋白转运抑制剂(Gorgin plug inhibitor)，继续孵育3 h。然后收集培养24 h的细胞，用PBS洗1遍后每管加100 μL的Fc Block 4 ℃反应15 min，胞外染色，所有样品加入CD3e -FITC抗体进行细胞表面染色，4 ℃避光放置30 min后每管加1 mL的staining buffer清洗细胞，离心后加入200 μL的Fixation and Permeabilization重悬细胞，再加1 mL的Perm/Wash buffer清洗细胞2遍，用TNF-α -PE抗体胞内染色，4 ℃避光放置30 min后清洗1遍，将细胞重悬于250 μL的staining buffer中后混匀，流式细胞仪收集10 000个细胞，计算CD3+T细胞亚群中TNF-α 阳性细胞的百分比。

2 结 果

2.1不同剂量TSST-1和姜黄素对脾细胞的毒性检测 正常状态时乳酸脱氢酶存在于细胞内，较难透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中，其数量与受损的细胞数目成正比。因此LDH是评价细胞损伤的的敏感指标。由表1可见，不同剂量的TSST-1组和姜黄素各干预组与阴性对照组相比差异无统计学意义，均无细胞毒作用，对脾细胞膜没有造成明显损伤。

2.2TSST-1对脾细胞炎性细胞因子的影响 TSST-1对脾细胞分泌的IFN-γ和IL-2的影响：与阴性对照组相比，TSST-1诱导IFN-γ和IL-2表现出一定的剂量效应关系，0.1 μg/mL和1 μg/mL TSST-1可诱导产生中等水平的IFN-γ和IL-2，3 μg/mL和5 μg/mL TSST-1组诱导两种细胞因子产量达到饱和且两组间差异无统计学意义(图1)。

表1不同剂量TSST-1和姜黄素对脾细胞的毒性作用

Tab.1CytotoxicityofdifferentdoseofTSST-1andcurcumintosplenocytes

GroupdoseOD value(x±s)Negative control01.285±0.042TSST-1(μg/mL)0.1 1.172±0.01911.196±0.05431.251±0.01651.286±0.046Curcumin(μmol/L)11.266±0.04961.255±0.098151.255±0.04220 1.185±0.052

图1不同剂量TSST-1诱导IFN-γ(A)、IL-2(B)和TNF-α(C)的水平

注：abc表示该组与其他组比较差异有统计学意义，P<0.05

Fig.1ProductionofIFN-γ(A),IL-2(B)andTNF-α(C)inducedbydifferentdoseofTSST-1

Note: The a, b, c means the group was significantly different compared with others,P<0.05.

TSST-1对脾细胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12的影响：TSST-1诱导脾细胞分泌低水平的TNF-α，3 μg/mL的TSST-1仅能诱导分泌46 pg/mL的TNF-α(图1)；未能检测到IL-1β、IL-6和 IL-12。

2.3姜黄素对TSST-1诱导脾细胞分泌的IFN-γ、IL-2和TNF-α的影响 姜黄素抑制TSST-1诱导的IFN-γ与其剂量有关，低浓度姜黄素(1 μmol/L和6 μmol/L)对1 μg/mL TSST-1诱导的IFN-γ无明显抑制作用，高浓度姜黄素(15 μmol/L和20 μmol/L)对IFN-γ分泌有显著抑制作用(P<0.05)且抑制程度接近。不同浓度姜黄素对IL-2产量均无明显抑制效应 (图2)。

姜黄素抑制TSST-1诱导的TNF-α也表现出一定剂量效应关系， 3 μmol/L和6 μmol/L姜黄素组与单独3 μg/mL TSST-1相比差异无统计学意义，说明低浓度无明显抑制作用，15 μmol/L和20 μmol/L姜黄素组分泌TNF-α显著降低(P<0.05)表现出显著的抑制效应(图3)。

2.4TSST-1诱导的脾细胞的增殖 脾细胞在3 μg/mL TSST-1作用24 h后显微镜下观察可以看

图2不同浓度姜黄素对TSST-1诱导的IFN-γ(A)和IL-2(B)的抑制作用

注：abc表示该组与其他组比较差异有统计学意义，P<0.05

Fig.2InhibitioneffectofcurcuminonproductionofIFN-γ(A)andIL-2(B)inducedbyTSST-1

The a, b, c means the group was significantly different compared with others,P<0.05.

图3不同浓度姜黄素对TSST-1诱导的TNF-α的抑制作用。

注：数值表示CD3+T细胞内TNF-α阳性细胞所占的百分比。流式图是3次独立实验的代表图，条形图为统计图见明显的成簇现象，表明脾细胞增殖，而阴性组细胞均一，15 μmol/L姜黄素干预组肉眼观察未见成簇明显减少。

Fig.3InhibitioneffectofcurcuminonproductionofTNF-αinducedbyTSST-1

The value means the percentage of TNF-α positive T cells of CD3+T cell. Flow cytometer figure was the representative of three independent experiments, bar chart was statistics figure.

图4脾细胞培养24h后的增殖情况(20×)，阴性(A)，3μg/mLTSST-1(B)，3μg/mLTSST-1和15μmol/L姜黄素(C)

Fig.4Proliferationofsplenocytesforculturingfor24h,negativecontrols(A),3μg/mLTSST-1(B),3μg/mLTSST-1,and15μmol/Lcurcumin(C)

图5IL-12抗体对LPS、TSST-1和TSST-1+姜黄素分泌IFN-γ的影响

注：*表示与阴性组比较差异有统计学意义，P<0.05

Fig.5Effectofanti-IL-12ontheproductionofIFN-γinsplenocytesinducedbyLPS,TSST-1andTSST-1combinedwithcurcumin

“*”means the group was significantly different compared with negative control,P< 0.05.

2.5IL-12对TSST-1诱导的IFN-γ的影响 利用400 ng/mL IL-12抗体中和脾细胞产生的IL-12,观察在阻断缺少IL-12条件下TSST-1和LPS分别诱导产生的IFN-γ产量。加入IL-12 中和抗体后，LPS诱导的IFN-γ产量减少了94.5%，TSST诱导的IFN-γ减少了60.3%， TSST-1与姜黄素共同作用的IFN-γ未见明显较少(图4)。该结果表明LPS诱导脾细胞产生IFN-γ最大程度依赖IL-12的参与，TSST-1诱导脾细胞产生IFN-γ只是部分依赖IL-12，姜黄素对IFN-γ的抑制作用不依赖IL-12。

3 讨 论

超抗原TSST-1不需要抗原提呈细胞(APC)加工处理可直接与其MHCⅡ类分子和特异的TCR Vβ结合形成三聚体激活高达20%的T细胞，是普通抗原的103～105倍。超抗原激活T细胞的同时活化抗原提呈细胞，上调其TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。TSS中的大量细胞因子是引起发热，低血压，多器官功能衰竭的主要原因。目前TSS的治疗包括抗休克、抗生素治疗和对症治疗，多数学者认为减少细胞因子的产生将有利于患者的生存。姜黄素作为天然的抗炎物质是否由有此功能值得研究。脾脏中T细胞约占淋巴细胞的40%，少量的树突状细胞和巨噬细胞具有抗原递呈功能，是模拟超抗原诱导免疫应答的体外细胞模型。本实验中各剂量毒素组与姜黄素组与阴性对照组相比均没有明显的细胞毒作用，表明所用的毒素与姜黄素剂量合适，没有对脾细胞膜造成明显损伤，所检测到的被分泌到细胞培养上清中的促炎因子产量能够比较真实地反应脾细胞的功能。本研究观察到TSST-1诱导小鼠脾细胞产生了大量的IFN-γ和IL-2，产生的TNF-α相对量少，未能检测到主要由巨噬细胞分泌的IL-1β、IL-6和IL-12。TSST-1激活特定亚群的T细胞分泌大量的IFN-γ和IL-2，IL-2正反馈促进T细胞的分化和增殖，进而使产生细胞因子的T细胞数目继续扩大，如此级联反应导致了细胞因子风暴。有报道TSST-1诱导的PBMC能分泌大量IL-1β、TNF-α和IL-6，与本实验有所区别的原因在于超抗原与小鼠APC上的MHCⅡ类分子的亲和力比人的HLAⅡ类分子低[5-6]。Faulkner也曾报道与FVB/N野生型相比，在HLA-DR1 TCRα+/-转基因的小鼠的脾细胞中，金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)能诱导出大量的 TNF-α 、IL-6和 IFN-γ[7]。本研究中观察到姜黄素作用于脾细胞能够抑制TSST-1诱导的IFN-γ和TNF-α的产量。以往研究表明TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ与小鼠模型中超抗原诱导的致病性有很大相关性[8-10]。Schaefers报道兔TSS模型中，存活兔血清中TNF-α比死亡的低[4]。TNF-α和IL-1β为内源性致热源，可引起机体发热[11]。IFN-γ主要由活化的T细胞产生，通过增加APC MHCⅡ类分子的表达加强免疫应答，同时上调TNF-α和IL-1受体的表达，与TNF-α、IL-1β协同作用促进内皮细胞粘附分子的表达进而促进白细胞的粘附与募集而促进炎症反应。本研究中未能观察到姜黄素对IL-2的作用效果。有研究报道姜黄素在6.25 μmol/L显著增强Con A或IL-2诱导的脾细胞增殖，在12.5 μmol/L则明显抑制[12]。本次试验的姜黄素随剂量增加IL-2有降低趋势，但差异无统计学意义。总之，姜黄素能降低IFN-γ和TNF-α未能改变IL-2的实验结果提示姜黄素不是通过抑制T细胞的增殖而是通过抑制了TSST-1诱导的胞内炎症因子的合成而发挥抗炎作用。

用LPS刺激脾细胞，巨噬细胞通过TLR4受体可激活系列信号通路促进分泌IL-12，IL-12进一步激活T细胞分泌IFN-γ 和IL-2。因此阻断IL-12后LPS诱导的IFN-γ 94.5%受到抑制。但阻断IL-12后TSST-1诱导的IFN-γ并没有完全被抑制，表明TSST-1激活脾细胞产生IFN-γ的机制与LPS激活机制不同，不完全依赖IL-12的作用，但确切机制还有待深入研究。阻断IL-12对姜黄素抑制IFN-γ的作用无明显影响，推测其可能原因是姜黄素通过抑制NF-κB的信号通路而抑制了巨噬细胞产生IL-12，在IL-12 已经被抑制的条件下进一步阻断IL-12不会看到显著的阻断效应。

综上，尽管本研究中姜黄素对TSST-1诱导的IL-2产量无明显作用，推测对姜黄素T细胞的增殖无显著作用，但姜黄素被证明能有效抑制IFN-γ和TNF-α的产量，表明姜黄素对TSST-1引起的炎症因子可能有一定的干预作用。由于小鼠与人的种属差异性，本研究未使用转基因小鼠，未能全部诱导出炎症因子，对姜黄素抑制TSS细胞因子风暴的明确作用及其机制尚需进一步实验证明。

参考文献：

[1]Callahan JE, Herman A, Kappler JW, et al. Stimulation of B10.BR T cells with superantigenic staphylococcaltoxins[J]. J Immunol, 1990, 144(7): 2473-2479.

[2]Russell JK. Pontzer CH, Johnson HM. The I-A beta b region (65-85) is a binding site for the superantigen, staphylococcal enterotoxin A[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 168(2): 696-701.

[3]Jurenka JS. Anti-inflammatory properties of curcumin, a major constituent ofCurciminlonga: a review of preclinical and clinical research[J]. Altern Med Rev, 2009, 14(2): 141-153.

[4]Schaefers MM, Breshears LM, Andeson MJ, et al. Epithelial proinflammatory response and curcumin-mediated protection from staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1[J]. PLoS One, 2012,7(3):e32813. DOI:10.1371/journal.pone.0032813

[5]Fraser JD. High-affinity binding of staphylococcal enterotoxins A and B to HLA-DR[J]. Nature, 1989, 339(6221): 221-223.

[6]Herman A, Croteau G, Sekaly RP, et al. HLA-DR alleles differ in their ability to present staphylococcal enterotoxins to T cells[J]. J Exp Med, 1990, 172(3): 709-717.

[7]Faulkner L, Cooper A, Fantino C, et al. The mechanism of superantigen-mediated toxic shock: not a simple Th1 cytokine storm[J]. J Immunol, 2005, 175(10): 6870-6877.

[8]Marrack P, Kappler J. The staphylococcal enterotoxins and their relatives[J]. Science, 1990, 248: 705-709.

[9]Stiles BG, Campbell YG, Castle RM, et al. Correlation of temperature and toxicity in murine studies of staphylococcal enterotoxins and toxic shock syndrome toxin-1[J]. Infect Immum, 1999, 67(3): 1521-1525.

[10]Miethke T, Duschek K, Wahl C, et al. Pathogenesis of the toxic shock syndrome: T cell mediated lethal shock caused by the superantigen TSST-1[J]. Eur J Immunol, 1993, 23(7): 1494-1500.

[11]Luheshi G, Rothwell N. Cytokine and fever[J]. Int Arch Immunol, 1996, 109(4): 301-307.

[12]Gao X, Kuo J, Jiang H, et al. Immunomodulatory activity of curcumin: suppression of lymphocyte proliferation, development of cell-mediated cytotoxicity, and cytokine productioninvitro[J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(1): 51-61.